本文關鍵詞：不對稱熒光PCR擴增白念珠菌ITS-2基因單鏈DNA實驗

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【摘要】：目的比較在限制性引物不同稀釋比例條件下,不對稱熒光聚合酶鏈反應(PCR)擴增白念珠菌5.8S rDNA與28S rDNA間內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)2(ITS-2)基因的單鏈DNA(ssDNA)的實際效果,探討其體系優(yōu)化方法。方法以常規(guī)PCR為對照,將20μmol/L的正向引物(P1)按照一定比例預稀釋后,分別與20μmol/L的熒光標記反向引物(P2')組成含不同P1水平的引物對,采用不對稱熒光PCR擴增真菌ITS-2,并對PCR產(chǎn)物進行電泳和測序分析,比較各實驗組擴增ssDNA的效果。結(jié)果不對稱熒光PCR成功擴增出白念珠菌ITS-2基因的ssDNA,隨著限制性引物水平的降低,ITS-2基因的雙鏈DNA(dsDNA)條帶逐漸變淡,而ssDNA條帶逐漸變亮;在限制性引物稀釋比例達到1∶90~1∶100時,ds DNA條帶已經(jīng)模糊不清,而ssDNA條帶則達到最亮。提示在此擴增體系條件下,ssDNA拷貝數(shù)最多,為不對稱熒光PCR擴增白念珠菌ITS-2基因ssDNA的最佳擴增條件。PCR產(chǎn)物測序也表明,dsDNA上方的條帶為ITS-2基因的ssDNA。結(jié)論通過優(yōu)化限制性引物水平,不對稱熒光PCR可以高效地擴增白念珠菌ITS-2基因的ssDNA。
【作者單位】： 上海市臨床檢驗中心臨床微生物室;蘇州大學附屬第二醫(yī)院檢驗科;
【關鍵詞】： 不對稱熒光聚合酶鏈反應 白念珠菌 ITS-基因 單鏈DNA
【基金】：上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會重點資助項目(20134010) 上海市自然科學基金項目(15ZR1436100)
【分類號】：R440
【正文快照】： 近年來,深部真菌感染的發(fā)病率大幅增加,特別是深部絲狀真菌感染的發(fā)病率正逐年明顯增加,在某些特定人群中其發(fā)病率甚至高于酵母樣真菌感染[1]。由于深部真菌感染早期診斷困難,且不同真菌對抗真菌藥物的敏感性存在較大差異[2],致使真菌引起的深部感染死亡率很高。因此,提高真菌

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本文編號：518594