本文關(guān)鍵詞：新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]利用新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New Dehli Metallo-β-lactamase 1, NDM-1)的原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)NDM-1與6×His標(biāo)簽的融合蛋白,通過(guò)親和層析法純化NDM-1蛋白,采用體內(nèi)培養(yǎng)法,能將穩(wěn)定分泌抗NDM-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3F8接種于BALB/c小鼠腹腔,制備鼠抗NDM-1單克隆抗體；以單克隆抗體和膠體金標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ),根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制原理,建立NDM-1的斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)方法,并應(yīng)用于細(xì)菌培養(yǎng)物中NDM-1的檢測(cè)。[方法]1.采用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)攜帶NDM-1的原核表達(dá)載體的宿主菌表達(dá)NDM-1-6×His的融合蛋白,以SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的分子量,將重組基因工程菌擴(kuò)大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá),最后采用親和層析法純化誘導(dǎo)的目的蛋白,并研究它的酶促動(dòng)力學(xué)特征。2.抗NDM-1單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)培養(yǎng)法,將能夠穩(wěn)定分泌抗NDM-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3F8接種于BALB/c小鼠腹腔,每只BALB/c小鼠接種106個(gè)雜交瘤細(xì)胞,共接種6只,獲得含有抗體的腹水36m1。通過(guò)親和層析法純化,5 ml親和層析柱,每次可獲得4.50 mg高純度的抗NDM-1單克隆抗體。采用ELISA法分析抗體免疫活性。3.膠體金及免疫金探針的制備采用檸檬酸三鈉還原法,成功制備20 nm膠體金溶膠；此基礎(chǔ)上建立抗NDM-1單克隆抗體的膠體金標(biāo)記條件：最佳標(biāo)記pH值為7.4,最佳標(biāo)記量為8μg抗NDM-1單克隆抗體/ml膠體金。采用ELISA方法分析了免疫金探針活性。[結(jié)果]1.表達(dá)并純化獲得具酶活性的NDM-1-6×His融合蛋白,經(jīng)酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明純化的融合蛋白具有較高的酶活性。2.NDM-1斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)方法的建立根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制原理,以金標(biāo)抗NDM-1單克隆抗體作為分析探針,NDM-1完全抗原NDM-1偶聯(lián)物作為包被抗原,羊抗鼠IgG為質(zhì)控點(diǎn),初步建立了NDM-1的斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)體系(dot immunogold assay, DIGA)。當(dāng)包被抗原濃度為6ng/ml,免疫金探針為原液時(shí),肉眼判定NDM-1陽(yáng)性,檢測(cè)限為6ng/ml,檢測(cè)時(shí)間為10 min左右.[結(jié)論]本研究獲得了高效的重組基因工程大腸桿菌表達(dá)菌株,制備鼠抗NDM-1單克隆抗體；以單克隆抗體和膠體金標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ),根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制原理,建立了NDM-1的斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)方法,并將其初步應(yīng)用于細(xì)菌培養(yǎng)物中NDM-1的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶1 原核表達(dá) 單克隆抗體 斑點(diǎn)金免疫
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R446
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-11
• 前言11-14
• 一、研究背景11-13
• 二、研究目的13-14
• 材料與方法14-32
• 一、材料14-21
• 二、方法21-32
• 結(jié)果32-43
• 一、NDM-1蛋白的純化及鑒定32-37
• 二、抗NDM-1單克隆抗體的制備及鑒定37
• 三、NDM-1斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)方法的建立37-43
• 討論43-47
• 一、NDM-1蛋白的鑒定分析43
• 二、抗NDM-1單克隆抗體的制備及鑒定分析43-44
• 三、NDM-1斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)方法的應(yīng)用分析44-47
• 小結(jié)47-48
• 創(chuàng)新與不足之處48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 文獻(xiàn)綜述55-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 致謝64-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄65-66
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表66

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 段薇,張健,鄭劍玲,蘇丹,王美慧;抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的研制[J];微生物學(xué)雜志;2004年05期

2 張唯敏;;新單克隆抗體已應(yīng)用于臨床[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));1986年04期

3 遲素敏;;單克隆抗體的制備和鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1986年Z1期

4 張明杰;單克隆抗體在農(nóng)業(yè)中有何用途?[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1991年02期

5 孫國(guó)鳳;;單克隆抗體藥品在日本通過(guò)調(diào)查會(huì)[J];生物技術(shù)通報(bào);1991年09期

6 ;一種制備單克隆抗體的更有效而經(jīng)濟(jì)的方法[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè));1998年05期

7 任新玲,沈麗英,金伯泉,井曉梅,王睿;表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體抗肺癌作用的研究[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年03期

8 章波,陳惠鵬,范國(guó)才,陳吉中,王清明;抗人肝再生增強(qiáng)因子單克隆抗體的研制[J];免疫學(xué)雜志;2000年06期

9 李鳳英,陳名道,顧衛(wèi)瓊,陳春榮,唐金鳳;人瘦素單克隆抗體的鑒定[J];放射免疫學(xué)雜志;2000年02期

10 陳志南,蔣建利;單克隆抗體——從鼠到人[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2000年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 徐爽;安萬(wàn)新;胡榮花;葉萍;孟祥昱;;不同方法收集單克隆抗體濃縮后的比較[A];中國(guó)輸血1999年年會(huì)暨紀(jì)念A(yù)BO血型發(fā)現(xiàn)100周年學(xué)術(shù)交流論文專輯[C];1999年

2 劉大維;高斌;;狂犬病毒單克隆抗體的研制[A];2010年中國(guó)科學(xué)院微生物研究所博士后學(xué)術(shù)年會(huì)暨第二屆博誼論壇論文摘要集[C];2011年

3 陳炅;;治療性單克隆抗體的作用靶點(diǎn)及臨床應(yīng)用[A];2013年中國(guó)臨床藥學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第九屆臨床藥師論壇論文集[C];2013年

4 徐爽;徐焱;;單克隆抗體在輸血領(lǐng)域的應(yīng)用探討[A];中國(guó)輸血1999年年會(huì)暨紀(jì)念A(yù)BO血型發(fā)現(xiàn)100周年學(xué)術(shù)交流論文專輯[C];1999年

5 彭虹;舒翠麗;劉永全;王華;高杰英;;抗人α4單克隆抗體的制備和鑒定[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

6 祭芳;史建榮;陳正賢;徐劍宏;陸瓊嫻;;抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體的制備[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

7 張光波;董秋明;於葛華;李文香;張學(xué)光;;一株鼠抗人4-1BB單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的鑒定[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

8 張錦超;楊金菊;吳瓊;李戩;陳勇;李輝;宋穎博;羅曉彤;任飛;高媛;杜雪梅;鞠艷芳;王兆卿;王京蘭;徐菡;柳曉蘭;崔玉芳;錢(qián)小紅;賀福初;高建恩;孫啟鴻;;高效鑒定單克隆抗體所識(shí)別未知抗原技術(shù)平臺(tái)的建立及應(yīng)用[A];中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)第二屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要論文集[C];2004年

9 楊永昌;王北寧;賴春寧;黎燕;;抗血小板單克隆抗體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

10 孫效;高新;尚明美;宋海峰;湯仲明;;抗胰高血糖素樣肽單克隆抗體的制備[A];第八次全國(guó)藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 記者 尹暉;單克隆抗體研發(fā)進(jìn)入新階段[N];無(wú)錫日?qǐng)?bào);2010年

2 編譯 李勇;單克隆抗體：生物類似藥開(kāi)發(fā)的秘鑰[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2014年

3 廣凱;單克隆抗體藥物將有大發(fā)展[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

4 ;單克隆抗體應(yīng)用前景看好[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

5 黃東臨;羅氏叱咤單克隆抗體市場(chǎng)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

6 ;單克隆抗體異軍突起[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

7 尹暉;全球最大單克隆抗體研制基地落戶無(wú)錫[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

8 尹暉;最大單克隆抗體研制項(xiàng)目在馬山奠基[N];無(wú)錫日?qǐng)?bào);2010年

9 數(shù)文;羅氏買(mǎi)進(jìn)抗癌單克隆抗體[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2008年

10 毛文波;單克隆抗體：征服癌癥的新方法[N];科技日?qǐng)?bào);2004年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 魏德強(qiáng);以植物病毒為載體建立新型的載體—半抗原免疫體系[D];東北林業(yè)大學(xué);2014年

2 王璞;以CD146為靶點(diǎn)的胃癌早期診斷多功能納米探針的相關(guān)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 張瀟;抗EV71病毒單克隆抗體及柯薩奇病毒病毒樣顆粒的制備研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2015年

4 鄒年莉;雞傳染性支氣管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 程林;人△42PD1特異性單克隆抗體的制備及其免疫功能的初步探討[D];南京大學(xué);2014年

6 王海;直腸癌上調(diào)表達(dá)蛋白eEF2單克隆抗體制備及臨床應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

7 孫佳善;禽流感、新城疫和犬瘟熱病毒單克隆抗體篩選策略比較及應(yīng)用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 胡新韜;HIV-1B'和CRF07_BC慢性感染者中和抗體應(yīng)答特征及CD4bs抗原特異性單克隆抗體分離鑒定初步研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2012年

9 白宇;馬γ-干擾素單克隆抗體的制備及細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)方法的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

10 余自強(qiáng);抗血小板膠原受體糖蛋白VI單克隆抗體的制備和功能研究[D];蘇州大學(xué);2005年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王曉磊;流行性乙型腦炎病毒單克隆抗體的制備與prM-E蛋白抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 葛新杰;NT-proBNP單克隆抗體的研制及ELISA定量檢測(cè)方法的建立[D];鄭州大學(xué);2015年

3 張標(biāo);鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的初步研究[D];蘇州大學(xué);2015年

4 鄭瑩;CD123在兒童B系急性淋巴細(xì)胞性白血病中的表達(dá)與抗人CD123單克隆抗體的制備[D];蘇州大學(xué);2015年

5 董倩;JEV NS2B蛋白單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 薛翼鵬;豬CR1-like單克隆抗體的制備及CR1-like在豬紅細(xì)胞膜表面分布狀態(tài)的研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 繆歡;JEV PrM/M蛋白單克隆抗體的制備及JEV P3感染U251細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 仲曉麗;犬副流感病毒單克隆抗體的制備及單鏈抗體蛋白的表達(dá)和活性鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 劉靜靜;綿羊早孕因子單克隆抗體的制備及鑒定[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 安蓮;B型流感嗜血桿菌寡糖綴合物疫苗的免疫活性研究相關(guān)單克隆抗體的制備[D];山東大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法建立及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：451970