本文關(guān)鍵詞：維生素E對鐵過負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景鐵是人體必需的微量元素之一,參與機(jī)體多種生理生化過程,包括氧氣運(yùn)輸、DNA合成、電子傳遞等。以往的研究主要集中在缺鐵性貧血,近年來,研究者發(fā)現(xiàn)鐵過負(fù)荷同樣對機(jī)體具有嚴(yán)重危害。肝臟是調(diào)控機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的主要器官,許多疾病伴有不同程度的肝鐵沉積,例如β-地中海性貧血(β-Thalassemia),該病患者由于反復(fù)輸血導(dǎo)致肝臟鐵沉積(又稱輸入性鐵過負(fù)荷),同時可見血清丙二醛(malonyldialdehyde, MDA)含量、炎性因子和轉(zhuǎn)氨酶升高。大量研究證實(shí),鐵通過催化Fenton反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxidative species, ROS),損害脂質(zhì)、蛋白、核酸,造成氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。近年來有研究報道,miR-122和miR-146a的表達(dá)變化在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。有意義的是,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),肝臟鐵過負(fù)荷除了可以引起肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷之外,還可以抑制肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子4a (Hepatocyte nuclear factor 4a, HNF4a)和miR-122和miR-146a表達(dá),進(jìn)而激活NF-κB信號通路,引起炎癥反應(yīng)。Vit.E (Vitamin E, Vit.E)作為一種廣泛應(yīng)用的抗氧化維生素,可清除體內(nèi)多余的ROS,維持機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡。有研究報道,Vit.E補(bǔ)充可降低鐵過負(fù)荷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。但是,另有研究報道,過量的Vit.E補(bǔ)充可加重鐵過負(fù)荷氧化應(yīng)激狀態(tài)。Vit.E對鐵過負(fù)荷氧化應(yīng)激的影響存在爭議。已知,臨床采用Vit.E防治地中海貧血患者紅細(xì)胞氧化損傷,其是否可以防治鐵過負(fù)荷引起的肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷以及炎癥反應(yīng)未見報道。研究目的本課題通過動物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn),觀察Vit.E補(bǔ)充對鐵過負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響,為今后臨床上是否采用Vit.E補(bǔ)充這一方法防治鐵過負(fù)荷肝臟損傷相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法一、動物分組與處理24只雄性4周齡C57BL/6小鼠,按體重隨機(jī)分組：對照組(Ctrl)、鐵過負(fù)荷(IO)組、鐵過負(fù)荷+玉米油(IO+corn oil)組、鐵過負(fù)荷+Vit.E (IO+Vit.E)組,每組6只。對照組腹腔注射0.9%生理鹽水,其余三組腹腔注射右旋糖酐鐵(20 mg/ml),每次0.15ml,每周2次,共2周,總鐵量12 mg。IO+Vit.E組小鼠每天灌胃溶于玉米油的Vit.E(100 mg/kg·bw), IO+corn oil組小鼠每天灌胃與Vit.E等體積的玉米油,共2周,IO+corn oil作為溶劑對照組。二、部分血清生化參數(shù)和肝鐵含量的檢測采用全自動血生化儀檢測各組小鼠血清中血清鐵(SI)、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(TS)、總鐵結(jié)合力(TIBC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等參數(shù)。硝化法測肝鐵含量。肝臟普魯士藍(lán)染色觀察肝鐵沉積情況。三、肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測ROS含量測定：制備小鼠肝臟組織勻漿液,離心吸取上清液,用ROS檢測探針DCF 37℃避光孵育1 h (DCF終濃度為5μM),酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量檢測：肝臟組織勻漿處理,然后按說明書操作進(jìn)行。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG):采用免疫熒光方法,操作按照說明書進(jìn)行。四、肝臟HE染色及炎癥病理評分肝臟組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋。攤片,厚度為4μm,然后用蘇木精和伊紅染色。顯微鏡下觀察并拍照,按照1985年lok.Schener評價慢性肝炎合并HDV感染方法進(jìn)行炎癥病理評分。五、細(xì)胞培養(yǎng)與處理人肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞分為對照組、Holo-Tf組(Holo-transferrin)和Holo-Tf+Vit.E組。Holo-Tf組加入Holo-Tf(終濃度為30 μM),Holo-Tf+Vit.E組同時加入Holo-Tf(終濃度為30μM)和Vit.E(終濃度為50 μM),對照組加入無菌RNase Free ddH2O,干預(yù)時間為24h。細(xì)胞羥自由基(·OH)含量、SOD活性、MDA含量、GSH含量的檢測：細(xì)胞用添加Holo-Tf和Vit.E的培養(yǎng)液培養(yǎng)后,制備肝細(xì)胞懸液,然后按說明書操作進(jìn)行。六、實(shí)時定量熒光PCR用Trizol裂解組織或者細(xì)胞,按比例加入氯仿進(jìn)行萃取。離心取上層水相,用異丙醇沉淀RNA。75%乙醇將沉淀洗2遍,得到的白色絮狀沉淀即為RNA。加入20μl左右RNase Free ddH2O溶解。測RNA濃度,再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照目的基因的正反引物及內(nèi)參基因正反引物,SYBR Green, cDNA, DEPC水進(jìn)行實(shí)時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。動物內(nèi)參為18S,細(xì)胞內(nèi)參為β-actin。根據(jù)擴(kuò)增得到的Ct值計(jì)算RQ值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。七、Western blot肝臟組織或細(xì)胞加入蛋白裂解液(lysis buffer:蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑：PMSF體積比為1 ml:1 μl:10 μl:5 μl)。經(jīng)勻漿、裂解、離心后,吸取蛋白上清液,然后上清液和loading buffer按4：1比例進(jìn)行蛋白變性。用BCA試劑盒定量。蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,加顯影液顯蛋白條帶,條帶進(jìn)行灰度分析,最終統(tǒng)計(jì)分析不同蛋白的表達(dá)情況。八、統(tǒng)計(jì)和分析數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS 21.0軟件分析。多組間比較采用方差分析。以P0.05,P0.01,P0.001表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠和Huh7細(xì)胞鐵狀態(tài)的影響1.小鼠的一般情況IO組與對照組比較,小鼠體重和進(jìn)食量無差異。IO+Vit.E與IO+corn oil組比較,小鼠體重和進(jìn)食量無差異。IO+Vit.E與IO+corn oil組小鼠的體重和進(jìn)食量低于對照組。2.小鼠的鐵負(fù)荷狀態(tài)(1)小鼠血清鐵相關(guān)參數(shù)和肝鐵含量與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠SI、TS、肝鐵含量均顯著升高。給鐵的同時給予Vit.E補(bǔ)充后,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間SI、TS、肝鐵含量無顯著性差異。與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟普魯士藍(lán)染色均可見明顯鐵沉積。(2)小鼠肝臟鐵代謝調(diào)節(jié)分子的表達(dá)變化與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟FTL1, HAMP mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高,TFRC mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低。而給鐵的同時給予Vit.E補(bǔ)充后,IO、IO+corn oil和IO+Vit.E組小鼠之間肝臟FTL1, TFRC, HAMP mRNA和蛋白表達(dá)無顯著性差異。3.鐵過負(fù)荷Huh7細(xì)胞鐵代謝調(diào)節(jié)分子表達(dá)變化與對照組比較,在添加30 μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7田胞鐵代謝調(diào)節(jié)分子FTL1, HAMP mRNA和蛋白表達(dá)升高,TFRC mRNA和蛋白表達(dá)降低。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細(xì)胞鐵代謝調(diào)節(jié)分子FTL1, HAMP, TFRC mRNA和蛋白表達(dá)無顯著性差異。二、Vit.E對鐵過負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(一)Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激的影響1. Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠肝臟ROS、MDA、GSH含量和SOD活性的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil組肝臟ROS和MDA含量升高,而SOD活性和GSH含量降低。與IO組比較,I0+Vit.E組肝臟ROS和MDA含量降低,而SOD活性和GSH含量升高。2. Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠肝臟8-OHdG含量的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil組肝臟8-OHdG熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。與IO組比較,IO+Vit.E組肝臟8-OHdG熒光強(qiáng)度減弱。(二)Vit.E對鐵過負(fù)荷Huh7細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響1. Vit.E對鐵過負(fù)荷Huh7細(xì)胞·OH含量的影響與對照組相比,在添加30 μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細(xì)胞內(nèi)·OH顯著升高；與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時分別添加0,25,50,100 μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細(xì)胞內(nèi)·OH含量呈現(xiàn)不同程度的降低,有一定的量效關(guān)系,但50μM組與100μM的·OH含量沒有明顯差異。2. Vit.E對鐵過負(fù)荷Huh7細(xì)胞MDA、GSH含量和SOD活性的影響與對照組相比,在添加30 μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h,Huh7細(xì)胞MDA含量升高,SOD活性和GSH含量降低。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細(xì)胞MDA含量有所降低,SOD活性和GSH含量有所升高。三、Vit.E對鐵過負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響(一)Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠肝臟組織炎癥反應(yīng)的影響1. Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠肝臟炎性因子表達(dá)的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)均升高。與IO組比較,IO+corn oil、IO+Vit.E組之間小鼠肝臟p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)無顯著性差異。2. Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠肝臟炎癥評分的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟HE染色病理切片的炎癥評分均顯著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間肝臟炎癥評分無顯著性差異。3. Vit.E對鐵過負(fù)荷小鼠血清AST、ALT水平的影響與對照組比較,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠血清AST、ALT水平均顯著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間血清AST、ALT水平無顯著性差異。(二)Vit.E對鐵過負(fù)荷Huh7細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響與對照組相比,在添加30 μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細(xì)胞炎性因子p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h,Huh7細(xì)胞p65,TNFα,IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)無顯著性差異。(三)Vit.E對鐵過負(fù)荷Huh7細(xì)胞HNF4α, miR-122, miR-146a, CCL2, TRAF6表達(dá)的影響在添加30 μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h,Huh7細(xì)胞HNF4α, miR-122, miR-146a表達(dá)顯著下調(diào),miR-122和niR-146a的靶基因CCL2,TRAF6表達(dá)顯著升高。與單純Holo-Tf組相比,在添加30 μM Holo-Tf同時添加50 μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h, Huh7細(xì)胞HNF4α, miR-122, miR-146a, CCL2, TRAF6表達(dá)無顯著性差異。結(jié)論綜合本課題的研究結(jié)果,表明,鐵過負(fù)荷可引起肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)；Vit.E補(bǔ)充可以緩解鐵過負(fù)荷引起的肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激,但不能緩解鐵過負(fù)荷引起的肝臟組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Vit.E補(bǔ)充對鐵過負(fù)荷肝細(xì)胞HNF4α及miR-122,miR-146a表達(dá)下降,NF-κB信號通路活性增強(qiáng)沒有明顯影響。因此,采用Vit.E補(bǔ)充防治鐵過負(fù)荷肝臟損傷相關(guān)疾病還需要進(jìn)一步深入研究。
【關(guān)鍵詞】：維生素E 鐵過負(fù)荷 氧化應(yīng)激 炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R459.3
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-18
• 中英文縮略詞表18-19
• 前言19-20
• 一、材料與方法20-35
• 二、結(jié)果35-44
• 三、討論44-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 全文總結(jié)50-51
• 綜述 鐵過負(fù)荷危害研究進(jìn)展51-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況58-59
• 致謝59-60

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本文編號：418533