發(fā)布時間：2024-02-29 22:56

　　第一部分白變藍(lán)克隆形成實驗對CRISPR/Cas9 AHI1基因編輯效率的應(yīng)用與驗證目的:CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯效率的高低受到多種因素影響,其中不同sg RNA序列對CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯效率的影響尤為重要。目前,評估不同sg RNA編輯效率高低的方法有多種,本課題的目的是檢驗白變藍(lán)克隆形成實驗這種原核評估體系是否也能用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)不同sg RNA編輯效率的評估,并篩選出針對AHI1基因的最優(yōu)編輯效率的sg RNA,為今后可能的針對該基因的基因治療提供參考。方法:本課題研究的白變藍(lán)克隆形成實驗應(yīng)用經(jīng)典的藍(lán)白篩選原理,首先,p MD-19T質(zhì)粒上編碼β-gal區(qū)域的部分序列被一段含有靶序列的長序列替換,從而形成移碼突變,替換后的質(zhì)粒稱為p MD-repeat質(zhì)粒,單獨(dú)轉(zhuǎn)化在含有X-gal和IPTG的固體培養(yǎng)基中不能形成藍(lán)色菌落;當(dāng)與裝載有靶序列對應(yīng)sg RNA的p Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化時,p MD-repeat質(zhì)粒中靶序列會被sg RNA引導(dǎo)的Cas9蛋白酶切,靶序列前后兩段重復(fù)序列發(fā)生同源重組,使編碼β-gal的基因序列由移碼恢復(fù)為非移碼狀態(tài),在X...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1pCas9質(zhì)粒的sgRNA克隆示意圖

隆形成實驗對CRISPR/Cas9基因編輯效率的評估及應(yīng)用表1選取的4條AHI1sgRNA序列sgRNA序列sgRNA15'-CTCGGATAATGTCTCCGCGATGGsgRNA25'-GATAATGTCTCCGCGATGGATGGsgRNA35'-....

圖2pMD-repeat質(zhì)粒lacZ基因部分堿基序列（紅框代表HIV重復(fù)序列；黑框代表

圖2pMD-repeat質(zhì)粒lacZ基因部分堿基序列（紅框代表HIV重復(fù)序列；黑框代表靶序列；紅框與黑框之間是KpnI和HindIII酶切位點）2.3.1pMD-repeat質(zhì)粒酶切、膠純化回收pMD-repeat質(zhì)粒中含有的長序列包含有KpnI和HindIII酶切位點，在重....

圖3pSpCas9(BB)-2A-GFP質(zhì)粒圖譜

圖3pSpCas9(BB)-2A-GFP質(zhì)粒圖譜(BB)-2A-GFP質(zhì)粒酶切、膠純化回收-2A-GFP質(zhì)粒酶切體系見表9；酶切后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂表9pSpCas9(BB)-2A-GFP載體酶切體系組分體積as9(BB)-2A-GFP質(zhì)粒2μBbsI酶（NEB）2μ0....

圖4白變藍(lán)克隆形成實驗原理示意圖

雙鏈的斷裂，兩段重復(fù)序列之間會發(fā)生同源重組，僅僅只有一條重復(fù)序列會存在lacZ基因的閱讀框，由移碼狀態(tài)變成非移碼狀態(tài)，在X-gal和IPTG誘導(dǎo)下，形成藍(lán)色菌落。（實驗原理示意圖見圖4）圖4白變藍(lán)克隆形成實驗原理示意圖2.5.1共轉(zhuǎn)化實驗含有sgRNA序列的pCas9質(zhì)粒和含....

本文編號：3915052