發(fā)布時(shí)間：2022-10-19 19:35

　　目的:收集、分離和純化江西地區(qū)白念珠菌臨床菌株,監(jiān)測(cè)白念珠菌對(duì)臨床常用的氟康唑（Fluconazole,FLU）、伊曲康唑（Itraconazole,ITR）、酮康唑（Ketoconazole,KETO）、5-氟胞嘧啶（5-Flucytosine,5-FC）和兩性霉素B（Amphotericin B,Am B）等5種抗真菌藥物的敏感性,獲得主要流行型別中的耐藥菌株,也為臨床白念珠菌感染診治提供一定的依據(jù)。通過(guò)RNA-seq技術(shù)獲得耐藥菌株5508（對(duì)FLU、ITR、KETO和5-FC耐藥）在5-FC、ITR和5-FC聯(lián)用ITR藥物處理下分別對(duì)比無(wú)藥處理的差異表達(dá)基因,進(jìn)一步采用融合PCR介導(dǎo)的LEU-HIS-ARG基因敲除策略、Spot assay和生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)等探討差異表達(dá)基因（QDR1基因）與白念珠菌耐藥性的關(guān)系,為下一步探索白念珠菌耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:1.收集、分離和純化臨床菌株,利用CHROMagar顯色培養(yǎng)基和多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction,M-PCR）鑒定法對(duì)念珠菌臨床標(biāo)本進(jìn)行鑒定,獲得白念珠菌臨床菌株;2.依照美國(guó)臨... 

【文章頁(yè)數(shù)】：99 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
第1章 引言
    1.1 白念珠菌
    1.2 白念珠菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
    1.3 白念珠菌基因敲除
    1.4 本論文的主要內(nèi)容
    1.5 本論文的研究意義
第2章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器和設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 菌株的培養(yǎng)及保存
        2.2.2 臨床念珠菌標(biāo)本的鑒定
            2.2.2.1 多重PCR鑒定
            2.2.2.2 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鑒定
        2.2.3 體外抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)
            2.2.3.1 藥敏板的配制
            2.2.3.2 菌懸液的制備與接種
            2.2.3.3 孵育及結(jié)果判讀
        2.2.4 白念珠菌RAPD基因分型實(shí)驗(yàn)
        2.2.5 白念珠菌總RNA的提取
        2.2.6 高通量測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組分析
            2.2.6.1 菌株處理和總RNA的提取
            2.2.6.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序
            2.2.6.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析
        2.2.7 熒光定量PCR
        2.2.8 酸化玻璃微珠法提取白念珠菌基因組DNA
        2.2.9 PCR介導(dǎo)的同源重組基因敲除組件構(gòu)建
            2.2.9.1 PCR同源臂和篩選標(biāo)記
            2.2.9.2 PCR片段切膠回收
            2.2.9.3 融合PCR擴(kuò)增同源重組基因敲除組件
            2.2.9.4 乙醇沉淀純化DNA片段
        2.2.10 乙酸鋰法轉(zhuǎn)化白念珠菌
        2.2.11 同源重組基因敲除突變株陽(yáng)性克隆的驗(yàn)證
            2.2.11.1 營(yíng)養(yǎng)型鑒定陽(yáng)性克隆
            2.2.11.2 PCR鑒定陽(yáng)性克隆
        2.2.12 白念珠菌細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.2.13 質(zhì)粒小量抽提
        2.2.14 白念珠菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        2.2.15 SpotAssay
        2.2.16 生物信息學(xué)方法
第3章 結(jié)果
    3.1 白念珠菌耐藥菌株的獲得
        3.1.1 臨床念珠菌的分離、純化和鑒定
        3.1.2 臨床白念珠菌抗真菌藥物敏感性
        3.1.3 臨床白念珠菌RAPD基因分型
    3.2 白念珠菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
        3.2.1 白念珠菌總RNA的提取與文庫(kù)構(gòu)建
        3.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)整理及質(zhì)量評(píng)估
        3.2.3 參考基因組注釋與基因組定位分析
        3.2.4 比對(duì)分析
        3.2.5 基因表達(dá)差異分析
        3.2.6 差異表達(dá)基因的GO分析
        3.2.7 差異表達(dá)基因的KEGG分析
        3.2.8 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的熒光定量PCR驗(yàn)證
    3.3 QDR1基因與白念珠菌耐藥性關(guān)系初探
        3.3.1 QDR1基因缺失突變株的構(gòu)建
            3.3.1.1 敲除組件的PCR擴(kuò)增
            3.3.1.2 對(duì)QDR1基因缺失突變株的鑒定
        3.3.3 QDR1基因?qū)Π啄钪榫拐婢幬锩舾行缘挠绊?br>        3.3.4 QDR1基因?qū)晟L(zhǎng)的影響
第4章 討論
    4.1 白念珠菌耐藥菌株的獲得
    4.2 白念珠菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)
    4.3 QDR1基因與白念珠菌耐藥性的關(guān)系
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士期間研究成果
綜述


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]深部真菌感染治療的現(xiàn)狀與對(duì)策[J]. 廖萬(wàn)清,顧菊林.  中國(guó)感染與化療雜志. 2007(02)

博士論文
[1]深部念珠菌的基因診斷、分子分型及耐藥機(jī)制研究[D]. 李勁松.天津醫(yī)科大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3693981