銅綠假單胞菌芳香硫酸酯酶（PAAS）為專利保護(hù)單通道雙酶同測(cè)ELLSA新方法的候選配對(duì)標(biāo)記酶及潛在化學(xué)發(fā)光新標(biāo)記酶,對(duì)其進(jìn)行分子工程改造篩選高活性突變體過程中,首次發(fā)現(xiàn)在最適反應(yīng)pH及溫度下,以對(duì)硝基苯酚硫酸鉀（PNS）為底物、不存在任何抑制劑的反應(yīng)體系中,PAAS/突變體有不同程度的反應(yīng)失活現(xiàn)象,即自催化反應(yīng)失活。通過動(dòng)力學(xué)測(cè)定、抗PAAS多克隆抗體和特定多肽影響及結(jié)構(gòu)分析等表征,推測(cè)可能機(jī)制,由此建立并優(yōu)化自催化反應(yīng)失活動(dòng)力學(xué)模型,且擬合抗PAAS多克隆抗體和多肽影響的動(dòng)力學(xué)過程,從而探討PAAS自催化反應(yīng)失活機(jī)制,并探索與其失活相關(guān)結(jié)構(gòu)因素,以期在分子改造過程中合理阻斷PAAS反應(yīng)失活。1.PAAS/突變體反應(yīng)失活1)同一反應(yīng)條件下,連續(xù)監(jiān)測(cè)PAAS/突變體在相同底物濃度及不同底物濃度下反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線,PAAS/突變體作用于其合成底物PNS時(shí),動(dòng)力學(xué)曲線出現(xiàn)不同程度的彎曲現(xiàn)象,即自催化反應(yīng)失活;反應(yīng)失活程度與底物濃度有關(guān)。突變體M72K反應(yīng)失活現(xiàn)象最明顯;超高分辨質(zhì)譜檢測(cè)催化反應(yīng)前后酶分子改變,發(fā)現(xiàn)M72K有氨基酸硫酸化共價(jià)修飾;2)引入抗PAAS多克隆抗體及合成的多肽（檢測(cè)出發(fā)... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PAAS/定點(diǎn)突變體催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

期間穩(wěn)定性反應(yīng)失活最嚴(yán)重的突變體 M72K 反應(yīng)期穩(wěn)定性對(duì)反應(yīng)失活的影響o analyze thermostability of M72K during catalytic reaction procesType (%) 0min 5min 10min 30minM72K 100.0% 96.2% 104.9% 98.4%的 M72K 純酶樣品置于室溫，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取酶樣并加果顯示 (表 2)，置于室溫持續(xù) 30min 后，M72K 活力下降K 反應(yīng)期間穩(wěn)定性并非是其失活的主要原因。 M72K 反應(yīng)失活的影響

制率仍低于 15%；室溫下，30 min 內(nèi) M72K 活性僅下降 5%，反應(yīng)期間；M72K 的 Km值為 32±1 μmol/L，最適反應(yīng) pH 為 9.0，以 3 mM PNS 為濃度，該濃度遠(yuǎn)大于 M72K 的 Km值，但 20 min 內(nèi)產(chǎn)物約生成 30 μM，足預(yù)設(shè)底物濃度的 1% (圖 3)，此為非正常情況的酶失活現(xiàn)象。該現(xiàn)象的物抑制、酶反應(yīng)期間穩(wěn)定性、底物過度消耗、反應(yīng) pH 與溫度皆無關(guān)，濃度依賴性，由此推測(cè)，此特殊酶失活現(xiàn)象可能是 M72K 酶蛋白在催化自身發(fā)生某種變化所引起，即自催化反應(yīng)失活。M72K 反應(yīng)失活中間體檢測(cè) 質(zhì)譜檢測(cè)催化反應(yīng)前后 M72K 酶蛋白


本文編號(hào)：3390042