發(fā)布時(shí)間：2021-05-24 12:17

　　肝素結(jié)合血凝素（HBHA）是分枝桿菌分泌的一種黏附素,它是由致病性分枝桿菌產(chǎn)生的一種糖蛋白,肺外播散性結(jié)核重要毒力因素之一。HBHA在胞內(nèi)分枝桿菌免疫診斷、治療和預(yù)防方面的應(yīng)用研究起重要意義。本文將構(gòu)建好的pET-32a-HBHA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21（DE3）中,在誘導(dǎo)劑IPTG作用下表達(dá)HBHA蛋白。經(jīng)組氨酸鎳柱純化濃縮,SDS-PAGE電泳鑒定,獲得約38 kDa大小,濃度為1.6 mg/ml的HBHA蛋白。應(yīng)用單克隆抗體技術(shù),以純化的胞內(nèi)分枝桿菌HBHA蛋白為免疫抗原制備抗胞內(nèi)分枝桿菌HBHA單克隆抗體,得到三株細(xì)胞上清效價(jià)為1:1600的細(xì)胞株,體內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)后,獲得大量效價(jià)為2.56×10⁵的抗體。并以HBHA單克隆抗體作為包被抗體建立胞內(nèi)分枝桿菌ELISA檢測(cè)方法。應(yīng)用棋盤法優(yōu)化檢測(cè)條件,同時(shí)試驗(yàn)對(duì)封閉液進(jìn)行了最佳選擇,對(duì)檢測(cè)樣品的特異性、敏感性和準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)估,評(píng)估結(jié)果顯示,該法對(duì)其他抗原均無交叉反應(yīng),有良好的特異性,能檢測(cè)菌體濃度為200個(gè)/ml,具有良好的敏感性,檢測(cè)準(zhǔn)確度高達(dá)93.3%,并成功組裝試劑盒。該試劑盒對(duì)家畜胞內(nèi)分枝桿菌病的診斷和防治具有... 

【文章來源】：長(zhǎng)春理工大學(xué)吉林省

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 前言
    1.2 非結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法
        1.2.1 細(xì)菌學(xué)鑒定分枝桿菌
        1.2.2 分子生物學(xué)鑒定分枝桿菌
    1.3 黏附素
        1.3.1 肝素結(jié)合血凝素
        1.3.2 HBHA結(jié)構(gòu)與功能
    1.4 HBHA研究進(jìn)展
    1.5 酶聯(lián)免疫吸附法
    1.6 研究目的及意義
第二章 胞內(nèi)分枝桿菌HBHA原核表達(dá)及蛋白純化
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 儀器及藥品
        2.1.2 主要試劑配制
    2.2 試驗(yàn)內(nèi)容
        2.2.1 菌體的活化
        2.2.2 pET-32a-HBHA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.2.3 菌體擴(kuò)大誘導(dǎo)
        2.2.4 HBHA蛋白純化及濃度測(cè)定
    2.3 試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 胞內(nèi)分枝桿菌HBHA蛋白純化
        2.3.2 胞內(nèi)分枝桿菌HBHA蛋白濃度測(cè)定
    2.4 小結(jié)
第三章 胞內(nèi)分枝桿菌HBHA單克隆抗體的制備
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 儀器及藥品
        3.1.2 試劑
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 BaLB/C鼠免疫
        3.2.2 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備
        3.2.3 飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備
        3.2.4 雜交瘤細(xì)胞融合
        3.2.5 雜交瘤細(xì)胞株篩選
        3.2.6 雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)
        3.2.7 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        3.2.8 單克隆抗體大量制備
        3.2.9 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定
    3.3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 小鼠免疫
        3.3.2 雜交瘤細(xì)胞株建立
    3.4 小結(jié)
第四章 胞內(nèi)分枝桿菌抗鼠全血清的制備
    4.1 試驗(yàn)材料
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 胞內(nèi)分枝桿菌的復(fù)蘇
        4.2.2 胞內(nèi)分枝桿菌抗血清的制備
    4.3 試驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 胞內(nèi)分枝桿菌抗鼠血清的制備
    4.4 小結(jié)
第五章 胞內(nèi)分枝桿菌ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用
    5.1 試驗(yàn)材料
        5.1.1 儀器及藥品
        5.1.2 試劑
    5.2 試驗(yàn)方法
        5.2.1 胞內(nèi)分枝桿菌雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
        5.2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化
        5.2.3 特異性試驗(yàn)
        5.2.4 敏感性試驗(yàn)
        5.2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)
    5.3 試驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 胞內(nèi)分枝桿菌雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
        5.3.2 單克隆抗體包被最佳濃度與抗鼠血清最佳濃度的確定
        5.3.3 最佳封閉液的確定
        5.3.4 特異性試驗(yàn)
        5.3.5 敏感性試驗(yàn)
        5.3.6 準(zhǔn)確度檢測(cè)
        5.3.7 待測(cè)樣品檢測(cè)
    5.4 小結(jié)
第六章 胞內(nèi)分枝桿菌ELISA檢測(cè)試劑盒的組裝
    6.1 試劑盒特點(diǎn)
    6.2 胞內(nèi)分枝桿菌ELISA檢測(cè)試劑盒使用說明書
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]萊茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗體制備及應(yīng)用[J]. 劉雁霞,樊振川.  中國生物工程雜志. 2017(11)
[2]應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法建立檢測(cè)非結(jié)核分枝桿菌的方法研究[J]. 陳淑丹,劉偉,羅鵬,鄭偉,呂沁風(fēng),吳忠華.  中華醫(yī)院感染學(xué)雜志. 2016(23)
[3]檢測(cè)犬弓形蟲SAG3抗體間接ELISA方法的建立[J]. 宋慧琦,楊升,高珺珊,宮鵬濤,李建華,張西臣.  中國病原生物學(xué)雜志. 2016(04)
[4]胞內(nèi)分枝桿菌HSP65基因克隆、分析及其原核表達(dá)的研究[J]. 葛淑敏,王誠,王準(zhǔn),錢愛東.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2015(03)
[5]雙抗夾心ELISA檢測(cè)犬糞賈第蟲抗原方法的建立及應(yīng)用[J]. 宋百軍,劉原源,宮鵬濤,李建華,楊舉,李赫,張西臣.  中國病原生物學(xué)雜志. 2014(10)
[6]抗流感嗜血桿菌外膜蛋白P6單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 溫曉艷,周芳,張彥霞,喬海霞,高雪,賈曉暉,張玉妥.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2014(10)
[7]胞內(nèi)分枝桿菌HBHA基因的克隆、分析及原核表達(dá)[J]. 葛淑敏,張淑華,何秀霞,于源華,錢愛東.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2014(04)
[8]非結(jié)核分枝桿菌感染的分子診斷研究進(jìn)展[J]. 趙建宏,李雅靜,溫海楠,楊靖.  檢驗(yàn)醫(yī)學(xué). 2012(03)
[9]結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J]. 張彩勤,江鷹,趙勇,毛峰峰,趙善民,白冰,師長(zhǎng)宏.  科學(xué)技術(shù)與工程. 2012(01)
[10]結(jié)核分枝桿菌肝素結(jié)合血凝素蛋白的表達(dá)、純化及免疫學(xué)特性的初步研究[J]. 江鷹,趙勇,張海,毛峰峰,張彩勤,白冰,師長(zhǎng)宏.  現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2011(S1)

博士論文
[1]以舒血寧注射液為示范的中藥0期（早期）臨床試驗(yàn)方法研究[D]. 梁麗喆.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 2016
[2]豬牛源非結(jié)核分枝桿菌分離鑒定及其主要基因的分析研究[D]. 王鐵峰.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]結(jié)核分枝桿菌黏附素HBHA的制備及其應(yīng)用研究[D]. 李傳友.北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 2005

碩士論文
[1]田鼠巴貝蟲FTA-LAMP及基于BmSA1和SRA5抗原的診斷技術(shù)建立[D]. 吳芬.中國疾病預(yù)防控制中心 2016
[2]抗H9N2亞型禽流感病毒X-19流行株單克隆抗體的制備及鑒定[D]. 張劍.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]牛分枝桿菌肝素結(jié)合血凝素（HBHA）的黏附功能鑒定[D]. 趙子惠.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]強(qiáng)力霉素單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立[D]. 劉金萍.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[5]藍(lán)舌病病毒8型VP2蛋白單克隆抗體的制備及B細(xì)胞表位鑒定[D]. 席娜.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[6]睪酮對(duì)小鼠卵泡體外發(fā)育的影響及小鼠Denndla基因慢病毒載體的構(gòu)建[D]. 牟曉莉.山東大學(xué) 2014
[7]豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白單克隆抗體的制備及抗原表位的鑒定[D]. 趙鑫.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[8]牛結(jié)核/布病雙重抗體檢測(cè)膠體金試紙條方法的初步建立[D]. 張策.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[9]L-羥脯氨酸單克隆抗體的制備及應(yīng)用[D]. 王麗莉.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[10]桃拉綜合征病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用[D]. 趙彥華.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



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