發(fā)布時(shí)間：2021-03-18 10:51

　　目的構(gòu)建載內(nèi)皮抑素（Es）重組表達(dá)質(zhì)粒的殼聚糖納米基因載體并評(píng)價(jià)其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。方法選用真核表達(dá)質(zhì)粒p VAX1為重組載體,采用PCR及雙酶切法制備能夠表達(dá)Tat PTD-Es融合蛋白的真核表達(dá)載體p VAX1/Tat PTD-Es;離子交聯(lián)法制備殼聚糖載基因納米粒,瓊脂糖凝膠電泳篩選處方,檢測(cè)納米粒的形態(tài)、Zeta電位及粒徑;采用最佳處方比例制備載重組質(zhì)粒納米載體,轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC,采用ELISA法測(cè)定分泌型Tat PTD-Es蛋白的表達(dá)量,CCK-8法測(cè)定對(duì)HUVEC的抑制作用,以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均以LipofectaminTM2000為陽性對(duì)照。結(jié)果 p VAX1/Tat PTD-Es的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,殼聚糖納米粒Zeta電位（14.3±1.6）m V,粒徑（145±12）nm,納米粒轉(zhuǎn)染HUVEC后細(xì)胞上清中Tat PTD-Es的濃度為（182.5±16.3）ng/m L,殼聚糖基因載體轉(zhuǎn)染HUVEC后對(duì)細(xì)胞有明顯的抑制作用,72 h的抑制率達(dá)（53.4±5.4）%（Z=-2.611,P=0.008）。結(jié)論構(gòu)建的殼聚糖納米基因載體能夠成功轉(zhuǎn)染HUVEC并... 

【文章來源】：山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2017,55(07)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

陽性重組質(zhì)粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ驗(yàn)證M:DNAmarkerI(100～600bp);1:陽性對(duì)照;2～4:陽性重組質(zhì)粒;5:陰性對(duì)照

ectamineTM2000轉(zhuǎn)染空載體pVAX1的細(xì)胞分別作為陰性對(duì)照。1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15．0軟件，每組試驗(yàn)重復(fù)5次，數(shù)據(jù)以x珋±s表示。在1．2．6中，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。在1．2．7中，CS納米粒(20μg/mL)分別與CSNPs陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)陽性對(duì)照比較，均采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1重組質(zhì)粒的驗(yàn)證PCＲ反應(yīng)結(jié)果顯示，陽性重組質(zhì)粒擴(kuò)增出600bp左右條帶，見圖1。抽提重組質(zhì)粒后經(jīng)EcoＲI、KpnI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，顯示3kb和600bp左右兩條帶。DNA測(cè)序表明，重組質(zhì)粒中的TatPTD-Es序列正確，無突變，且插入方向正確。2．2處方篩選2．2．1CS與DNA的最佳包合比篩選瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)CS∶DNA大于或等于20∶1時(shí)，DNA可完全滯留在加樣孔中，并且隨著CS比例增加，有更多的納米粒滯留在加樣孔中。圖1陽性重組質(zhì)粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ驗(yàn)證M:DNAmarkerI(100～600bp);1:陽性對(duì)照;2～4:陽性重組質(zhì)粒;5:陰性對(duì)照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．圖2重組質(zhì)粒pVAX1/TatPTDEs的雙酶切驗(yàn)證1:重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重組質(zhì)粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．圖3瓊脂糖凝膠電泳篩選CS-DNA最佳包合

eyU檢驗(yàn)。在1．2．7中，CS納米粒(20μg/mL)分別與CSNPs陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)陽性對(duì)照比較，均采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1重組質(zhì)粒的驗(yàn)證PCＲ反應(yīng)結(jié)果顯示，陽性重組質(zhì)粒擴(kuò)增出600bp左右條帶，見圖1。抽提重組質(zhì)粒后經(jīng)EcoＲI、KpnI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，顯示3kb和600bp左右兩條帶。DNA測(cè)序表明，重組質(zhì)粒中的TatPTD-Es序列正確，無突變，且插入方向正確。2．2處方篩選2．2．1CS與DNA的最佳包合比篩選瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)CS∶DNA大于或等于20∶1時(shí)，DNA可完全滯留在加樣孔中，并且隨著CS比例增加，有更多的納米粒滯留在加樣孔中。圖1陽性重組質(zhì)粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ驗(yàn)證M:DNAmarkerI(100～600bp);1:陽性對(duì)照;2～4:陽性重組質(zhì)粒;5:陰性對(duì)照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．圖2重組質(zhì)粒pVAX1/TatPTDEs的雙酶切驗(yàn)證1:重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重組質(zhì)粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．圖3瓊脂糖凝膠電泳篩選CS-DNA最佳包合比Fig．3ScreeningoftheopticalratioofCSandDNAbyagar-osegelelectrophoresis


本文編號(hào)：3088198