人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)是一種重要的蛋白酶,它可以特異性識別并切除DNA中的脫氧次黃嘌呤和各種烷基化嘌呤。hAAG在維持基因組完整性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,它參與細胞周期調(diào)控和細胞凋亡,并且和各種癌癥如肺癌和宮頸癌等息息相關(guān)。除此之外,hAAG能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生移碼突變和人體細胞中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定。因此,準確并且靈敏檢測hAAG活性對于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷都至關(guān)重要。為了提高檢測靈敏度,自20世紀90年代初以來,已開發(fā)了多種等溫核酸擴增技術(shù),并可用于多種不同目標物的測定,如蛋白質(zhì),細胞,小分子和離子等。與聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)相比,等溫核酸擴增具有快速高效的特點,可在簡單條件下(如水浴)進行,在恒定溫度下即可實現(xiàn)10~n倍的信號放大,對于低濃度疾病標志物的檢測具有重要意義。基于此,本論文在前人工作的基礎(chǔ)上,圍繞等溫核酸擴增技術(shù)檢測hAAG開展了以下研究內(nèi)容:第一章:主要介紹了DNA糖苷酶和常用的等溫核酸擴增技術(shù),并重點介紹了目前基于等溫核酸擴增技術(shù)檢測DNA糖苷酶的方法。第二章:建立了一種簡單的末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)激活的-核酸內(nèi)切酶IV(Endo IV)輔助的超分支信號擴增方法靈敏檢測hAAG。該方法極其簡單,整個反應(yīng)只需設(shè)計兩種核酸序列,反應(yīng)時間只需要~100 min。采用3'-NH_2修飾的發(fā)夾探針和信號探針抑制TdT激活的非特異性擴增,使得反應(yīng)體系產(chǎn)生低的背景信號,并且結(jié)合高效率的超分支擴增技術(shù),該方法具有較高的靈敏度,檢測限為0.09032U/mL,線性范圍為0.1到50 U/mL,可以達到3個數(shù)量級,并可用于復(fù)雜HeLa細胞核提取物中hAAG的準確檢測。該方法還可用于區(qū)分hAAG與其它DNA糖苷酶。第三章:發(fā)展了一種基于堿基切除修復(fù)調(diào)制的三重級聯(lián)信號擴增方法高靈敏檢測DNA糖苷酶。目標物hAAG引發(fā)SDA反應(yīng),生成的產(chǎn)物作為引物觸發(fā)PG-RCA與基于Endo IV輔助的循環(huán)信號放大反應(yīng),利用三重級聯(lián)信號擴增技術(shù)的高效率和UDG糖苷酶調(diào)制擴增的低背景,該方法具有高的靈敏度,對于hAAG的測定,檢測限低至0.02612 U/mL。此外,該方法也可進一步定量HeLa細胞提取物中hAAG的活性。第四章:建立了一種基于hAAG引發(fā)、TdT酶調(diào)制的合成CuNPs并無標記檢測hAAG活性的熒光方法。TdT酶可以將dTTPs聚合添加到hAAG切割反應(yīng)產(chǎn)生的具有3'-OH末端的核酸上,形成聚T核酸序列,該序列可以與具有AP位點的輔助模板和輔助探針雜交形成穩(wěn)定的dsDNA,而Endo IV會切割dsDNA上的AP位點,繼續(xù)產(chǎn)生具有3'-OH末端的核酸。在TdT酶和Endo IV的共同作用下,整個反應(yīng)反復(fù)循環(huán),最終產(chǎn)生大量的聚T核酸序列。最后,以聚T核酸序列為模板合成具有熒光信號的CuNPs并定量檢測hAAG的活性。與之前通過熒光試劑和猝滅劑標記的方法相比,該方法無需標記,成本低,穩(wěn)定性好,并且具有良好的選擇性。第五章:結(jié)論。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R440
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 綜述
    1.1 前言
    1.2 堿基切除修復(fù)反應(yīng)
    1.3 DNA糖苷酶
    1.4 等溫核酸擴增技術(shù)
        1.4.1 鏈置換擴增技術(shù)（SDA）
        1.4.2 指數(shù)擴增技術(shù)（EXPAR）
        1.4.3 滾環(huán)擴增技術(shù)（RCA）
        1.4.4 雜交鏈反應(yīng)（HCR）
        1.4.5 級聯(lián)放大技術(shù)
        1.4.6 等溫核酸擴增技術(shù)的應(yīng)用
    1.5 基于等溫核酸擴增技術(shù)檢測DNA糖苷酶
        1.5.1 比色法
        1.5.2 熒光法
        1.5.3 生物發(fā)光法
        1.5.4 電化學(xué)法
    1.6 選題思路和主要研究內(nèi)容
第二章 靶向調(diào)制的超支化擴增檢測HeLa細胞中的人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    2.1 前言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 試劑和材料
        2.2.2 hAAG活性檢測方法
        2.2.3 凝膠電泳分析
        2.2.4 細胞培養(yǎng)和細胞核提取物的制備
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 設(shè)計原理
        2.3.2 可行性分析
        2.3.3 條件優(yōu)化
        2.3.4 hAAG活性分析
        2.3.5 選擇性分析
        2.3.6 實際樣品分析
    2.4 結(jié)論
第三章 堿基切除修復(fù)調(diào)制的三重級聯(lián)信號擴增高靈敏檢測人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    3.1 前言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 試劑和材料
        3.2.2 DNA儲備液的制備
        3.2.3 hAAG活性檢測方法
        3.2.4 凝膠電泳分析
        3.2.5 細胞培養(yǎng)和細胞核提取物的制備
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 設(shè)計原理
        3.3.2 可行性分析
        3.3.3 條件的優(yōu)化
        3.3.4 hAAG活性分析
        3.3.5 選擇性分析
        3.3.6 實際樣品分析
    3.4 結(jié)論
第四章 基于目標物引發(fā)的熒光CuNPs的合成無標記檢測人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    4.1 前言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 試劑和材料
        4.2.2 DNA儲備液的制備
        4.2.3 hAAG活性檢測方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 設(shè)計原理
        4.3.2 可行性分析
        4.3.3 條件優(yōu)化
        4.3.4 hAAG活性分析
        4.3.5 選擇性分析
    4.4 結(jié)論
第五章 結(jié)論
參考文獻
在學(xué)期間的研究成果
致謝

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本文編號：2878828