缺血性腦卒中是全球主要致死性疾病之一,占全球死亡病因的5.2%。缺血性腦卒中通常是由血栓或栓子阻斷大腦動(dòng)脈血流供應(yīng),引起短暫或永久的腦血流減低所致。短暫性腦血供減少或喪失會(huì)觸發(fā)腦缺氧-再灌注損傷,誘發(fā)大量活性氧/氮(reactive oxygen and/or nitrogen species,ROS/RNS 或 RONS)的產(chǎn)生。大量產(chǎn)生的RONS被認(rèn)為是介導(dǎo)腦缺血-再灌注后神經(jīng)元損傷最主要的因子,靶向RONS的抗氧化劑也由此成為一種能保護(hù)神經(jīng)元免受RONS損傷和改善缺血性腦卒中預(yù)后的理想藥物。目前,以新型納米材料為基礎(chǔ)合成的抗氧化納米酶,因具有穩(wěn)定的酶樣活性、較強(qiáng)的抗氧化性質(zhì)、良好的生理穩(wěn)定性和較低的合成成本等優(yōu)勢(shì)引起了廣泛關(guān)注。普魯士藍(lán)是一種美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的銫和鉈中毒的解毒劑,具有良好的生物安全性�；谄蒸斒克{(lán)合成的納米粒因具有磁/光性能、可控的理化性質(zhì)以及多孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢(shì),已被開發(fā)為多模態(tài)顯像探針、藥物載體和光熱轉(zhuǎn)換劑等,在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。此外,普魯士藍(lán)納米粒因其具有過氧化氫酶、超氧陰離子歧化酶和過氧化物酶等多酶樣活性,可作為有效的RONS清除劑。然而,其能否起到保護(hù)神經(jīng)元、改善缺血性腦卒中等RONS相關(guān)疾病預(yù)后的作用,尚無研究報(bào)道。正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography,PET)是一種無創(chuàng)的可在細(xì)胞和分子水平上在體顯示機(jī)體生物活動(dòng)的新型分子影像技術(shù)。18氟-脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)PET成像能夠反映機(jī)體細(xì)胞水平的葡萄糖代謝情況和細(xì)胞的活性,已用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和療效評(píng)估。本研究旨在通過提出綠色安全、簡(jiǎn)單便捷的合成方法,合成新型空心普魯士藍(lán)納米酶(hollow Prussian blue nanozymes,HPBZs),并將其應(yīng)用于缺血性腦卒中,從納米技術(shù)、體外細(xì)胞和活體動(dòng)物水平,探究其神經(jīng)元保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制;同時(shí),基于18F-FDG PET成像,活體評(píng)估HPBZs在缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用和效果,為普魯士藍(lán)納米粒的臨床轉(zhuǎn)化提供研究基礎(chǔ)。第一部分HPBZs合成、表征以及性能檢測(cè)本部分研究通過研發(fā)Bi3+介導(dǎo)的無模板空心納米粒合成方法,成功制備了HPBZs。該方法合成路徑簡(jiǎn)單,無需復(fù)雜的預(yù)處理和苛刻的合成條件。制備的HPBZs為直徑約65 nm、大小均一、分散均勻的空心納米粒,在生理環(huán)境下能夠維持穩(wěn)定的水合動(dòng)力學(xué)直徑,表現(xiàn)出良好的生物學(xué)穩(wěn)定性。此外,HPBZs具有多酶樣活性、可變的價(jià)態(tài)和較強(qiáng)的氧化還原性能,不僅能夠?qū)⒍拘訰OS轉(zhuǎn)化為無毒的水分子和氧氣,而且能夠有效地清除RNS。同時(shí),空心結(jié)構(gòu)賦予HPBZs更大的比表面積,增大HPBZs與RONS接觸面積,從而提高HPBZs清除RONS的效能。本部分研究結(jié)果為HPBZs在缺血性腦卒中中清除大量產(chǎn)生的RONS從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第二部分HPBZs發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究該部分主要研究了 HPBZs在體外細(xì)胞水平的保護(hù)作用,并進(jìn)一步探討其發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。首先,我們建立了體外細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,結(jié)果顯示,HPBZs能夠抵抗氧化應(yīng)激損傷,保護(hù)神經(jīng)元;隨后構(gòu)建了氯化鈷誘導(dǎo)的體外細(xì)胞缺氧模型,結(jié)果顯示HPBZs能夠降低RONS水平,調(diào)控凋亡蛋白p53和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),從而保護(hù)缺氧受損的神經(jīng)元;此外,我們還構(gòu)建了體外炎癥模型,結(jié)果表明HPBZs能夠通過減少炎癥介質(zhì)環(huán)氧合酶-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá),抑制炎癥因子IL-1β的釋放,發(fā)揮體外細(xì)胞抗炎作用。綜上所述,HPBZs可能通過減少RONS、抵抗細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。第三部分HPBZs發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究該部分主要研究了 HPBZs對(duì)缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)元保護(hù)作用,并進(jìn)一步探索其發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制。我們采用經(jīng)典的致大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻線栓法構(gòu)建了腦缺血-再灌注損傷大鼠模型,并于腦缺血-再灌注前2天、腦缺血-再灌注后1小時(shí)、4小時(shí)或8小時(shí)側(cè)腦室注射HPBZs(40 μg/mL,10μL),結(jié)果顯示,腦缺血-再灌注前2天或缺血-再灌注后1小時(shí)側(cè)腦室注射HPBZs可顯著減少大鼠腦梗面積、改善大鼠腦缺血區(qū)葡萄糖代謝和促進(jìn)大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能恢復(fù);進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HPBZs可能通過降低腦內(nèi)RONS水平、抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和抵抗神經(jīng)元凋亡,發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用以拮抗缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。同時(shí),初步的活體生物安全性評(píng)估(包括18F-FDG PET成像、神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試以及2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色分析)結(jié)果顯示,HPBZs具有良好的生物安全性。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R743;R817.4
【部分圖文】：

在磁攪拌的作用下使鉍離子充分溶解并與ＰＶＰ反應(yīng)；同時(shí)將Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、ＰＶＰ和??１Ｍ鹽酸在磁攪拌的作用下充分溶解；最后，將上述兩種反應(yīng)溶液混合搖勻，放置??于８０°Ｃ烘箱中反應(yīng)２４小時(shí)，即可獲得ＨＰＢＺｓ?（圖１．１）。ＨＰＢＺｓ合成路徑簡(jiǎn)單，??無需復(fù)雜苛刻的合成條件。??ｆ?ＩＷＣ＇ＮＵ＇－谷【ＦｒｔＣＮＷ＊』．Ｆ〇‘?［ＦｃｉＣＮＵ＊－Ｆｃ??醒＋ｂ－飄４?ｉ?〇??Ｂｉ．，ｐｖｐ?ｉｍｉ－ｎｗＦ－ｐｖｐ?｜??＇＇?ｘ?ＢｎＦｄＣＮＵ＇＾ＩＦｅｉＣＮｖｒ?Ｂｉ?ｈｏｌｌｏｕ?Ｐｒｕｓｓｉａｎ?ｂｌｕｅｎａｎｏｅｎｚ＞ｍｅｓ??ｉｔ?Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ?ｓｔａｔｅ?｝ｅ?Ｊ??〇?Ｂｉ！?－ＰＶＰ?＊｜Ｆｅ（ＣＭ?｜＊－ＰＶＦ＊?＿?［Ｉ?〇＜〇?Ｊ４?．ＰＶＰ?▲ｈｒ＇．－ＰＶＰ??圖１．１?ＨＰＢＺｓ合成路徑示意圖。??此外，我們發(fā)現(xiàn)，在沒有添加Ｂｉ（Ｎ０３）３條件下，普魯士藍(lán)納米酶呈現(xiàn)實(shí)心球??型（圖１．２ａ）；而在添加Ｂｉ（Ｎ０３）３后，它們開始呈現(xiàn)空心結(jié)構(gòu)（圖１．２ｂ－ｅ），且??ＨＰＢＺｓ的空腔大小隨Ｂｉ（Ｎ０３）３的濃度變化而改變（圖１．２ｂ－ｅ）。當(dāng)Ｂｉ（Ｎ０３）３增加??到０．５?ｍｍｏｌ時(shí)，ＨＰＢＺｓ直徑甚至小于１００?ｎｍ?（圖１．２?ｅ）。隨著Ｂｉ３＋的過度加入，??電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)到的Ｆｅ：?Ｂｉ的混合摩爾比保持在１７：?１的水平。ＢＰ＋離??子在ＨＰＢＺｓ的空腔形成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用（圖１．２ｆ）。??ｍｍｍ??５??

?１?Ｍ?２?Ｍ??圖１．３多種濃度鹽酸混合下普魯士藍(lán)納米酶的透射電鏡圖。在磁攪拌下，不同濃度的鹽酸（濃度??分別為?０．０００１、０．０１、０．１、１?和?２Ｍ）與?ＰＶＰ?（５ｇ）、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３％ｍｇ）混合制備的普魯士藍(lán)??納米酶的透射電鏡圖像。??ｆｉ＾ＳＬ?°??ＨＢＢｆＢ??圖１．４?Ｇｄ＿１＋取代Ｂｉ３＋制備的普魯士藍(lán)納米酶的透射電鏡圖像。在磁攪拌下，將ＰＶＰ?（５ｇ）、??Ｇｄ（Ｎ０３）３、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３９６ｍｇ）和鹽酸溶液（１Ｍ，?４０ｍＬ）混合，得到澄瀆混合溶液，后??將盛有該溶液的小燒瓶放入８０°Ｃ的烘箱內(nèi)２４小時(shí)。隨后進(jìn)行離心、蒸餾水多次洗滌，最終獲??得實(shí)心的Ｇｄ３＋－普魯士藍(lán)納米酶。??３．３?ＨＰＢＺｓ的表征??為明確所制備的ＨＰＢＺｓ的物理化學(xué)特性，我們對(duì)ＨＰＢＺｓ進(jìn)行了詳細(xì)的表征。??從透射電鏡圖（圖１．５?ａ），我們觀察到，所制備的ＨＰＢＺｓ的直徑約為６５?ｎｍ，大小??均一，具有明顯的空心結(jié)構(gòu)和良好的單分散性。電子衍射圖（圖１．５?ｂ）和Ｘ線衍??射圖（圖１．６）顯示所制備的ＨＰＢＺｓ具有良好的結(jié)晶性。進(jìn)一步分析Ｘ線衍射圖??（圖１．６）

納米酶的透射電鏡圖像。??ｆｉ＾ＳＬ?°??ＨＢＢｆＢ??圖１．４?Ｇｄ＿１＋取代Ｂｉ３＋制備的普魯士藍(lán)納米酶的透射電鏡圖像。在磁攪拌下，將ＰＶＰ?（５ｇ）、??Ｇｄ（Ｎ０３）３、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３９６ｍｇ）和鹽酸溶液（１Ｍ，?４０ｍＬ）混合，得到澄瀆混合溶液，后??將盛有該溶液的小燒瓶放入８０°Ｃ的烘箱內(nèi)２４小時(shí)。隨后進(jìn)行離心、蒸餾水多次洗滌，最終獲??得實(shí)心的Ｇｄ３＋－普魯士藍(lán)納米酶。??３．３?ＨＰＢＺｓ的表征??為明確所制備的ＨＰＢＺｓ的物理化學(xué)特性，我們對(duì)ＨＰＢＺｓ進(jìn)行了詳細(xì)的表征。??從透射電鏡圖（圖１．５?ａ），我們觀察到，所制備的ＨＰＢＺｓ的直徑約為６５?ｎｍ，大小??均一，具有明顯的空心結(jié)構(gòu)和良好的單分散性。電子衍射圖（圖１．５?ｂ）和Ｘ線衍??射圖（圖１．６）顯示所制備的ＨＰＢＺｓ具有良好的結(jié)晶性。進(jìn)一步分析Ｘ線衍射圖??（圖１．６），發(fā)現(xiàn)所制備的ＨＰＢＺｓ的峰與標(biāo)準(zhǔn)卡片中的普魯士藍(lán)峰（ＰＤＦ：?７３－０６８７）??一致
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本文編號(hào)：2875998