發(fā)布時間：2020-11-08 17:23

　　 蛋白質是一類重要的生物大分子,是生命功能的主要承擔者。當具有某種特定功能的蛋白質發(fā)生表達異�；蚬δ墚惓r,可能導致機體發(fā)生病變甚至癌變。蛋白質的表達研究能夠揭示細胞的生理或病理狀態(tài),揭示藥物或環(huán)境等因素對細胞的影響,幫助我們深入地了解生理和病理現(xiàn)象,了解疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療效果。而生物樣本中特定蛋白質的檢測對于疾病的診斷、治療和藥物篩選等也具有十分重要的意義。具有診斷和治療意義的蛋白質通常在體液中的含量極低,加上生物體內(nèi)源性物質的干擾,這就使得這些蛋白質的檢測方法必須具有較高的靈敏度和特異性。目前,常用的蛋白質檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附測試(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、電泳法、質譜法、電化學法和熒光法等。其中,熒光法具有靈敏度高、特異性強和操作簡單的優(yōu)勢。近年來,以納米材料擴增技術和核酸擴增技術為基礎構建的蛋白質靈敏檢測方法為生物樣本中蛋白質的分析提供了有利手段。本論文以滾環(huán)擴增(Rolling circle amplification,RCA)、雜交鏈式反應(Hybridization chain reaction,HCR)和催化發(fā)夾自組裝(Catalytic hairpin assembly,CHA)等擴增策略為基礎,選擇血小板源生長因子 BB(Platelet-derived growth factor,PDGF-BB)、腫瘤壞死因子 a(Tumor necrosis factor a,TNF-a)、干擾素γ(Interferon γ,IFN-γ)和酪氨酸蛋白激酶7(Tyrosine protein kinase 7,PTK7)為分析模型,構建了用于生物樣本中或細胞膜表面蛋白質檢測的新型熒光生物傳感方法。本論文主要分為六章:第一章為緒論部分,主要概述了蛋白質的功能、檢測意義和蛋白質的靈敏檢測方法,以及本論文解決的科學問題和主要研究內(nèi)容。第二章,構建了一個新型“自封閉”適體探針,該探針包含兩個功能區(qū)域:(1)適體序列,位于探針的3'末端,具有目標物識別的功能;(2)信號轉導序列,位于探針的5'末端,具有信號轉導的功能。另外,探針的適體序列與信號轉導序列可部分雜交,具有“自我封閉”的功能。在相同堿基數(shù)目的情況下,分子內(nèi)雜交較分子間雜交更穩(wěn)定,因此,該“自封閉”適體探針較己報道的阻滯鏈封閉的適體探針更穩(wěn)定,有利于降低探針非特異性折疊產(chǎn)生的背景信號。結合鏈取代擴增反應(Strand displacement amplification,SDA)和雙重指數(shù)型滾環(huán)擴增反應(Dual exponential rolling circle amplification,DE-RCA),我們構建了一個“自封閉”適體探針介導的級聯(lián)擴增策略,實現(xiàn)了 PDGF-BB的超靈敏檢測,檢測限為0.38 fM,線性范圍超過6個數(shù)量級,優(yōu)于阻滯鏈封閉的適體探針介導的相同擴增策略的結果。通過替換探針中的適體序列,本方法還實現(xiàn)了對小分子腺苷的靈敏、特異檢測,說明該策略能夠拓展用于多種目標物的靈敏分析,在生物檢測領域具有較大的應用潛力。第三章,構建了一個DNA發(fā)夾結構催化組裝驅動的三維DNA walker。該walker以核酸修飾的磁納米顆粒(Magnetic nanobeads,MNBs)為運行軌道,以單純的DNA雜交反應為驅動力,能夠在核酸或蛋白質的觸發(fā)下自發(fā)進行。與酶驅動的三維DNA walker相比,該催化組裝驅動的DNA walker更加簡單和通用,通過更換識別元素,可用于核酸和蛋白質等生物分子的分析。以Smallpox gene為核酸分析模型,本方法的檢測限達4.1 fM;以PDGF-BB為蛋白分析模型,檢測限達2.3 fM,說明該walker體系可用于多種特定目標物的檢測,在生物傳感領域具有較大的應用價值。第四章,構建了一個基于雙條碼策略和單分子計數(shù)的細胞因子多重檢測方法。IFN-γ和TNF-α與一系列生理和病理過程如肺結核、HIV感染和黑色素瘤等密切相關,因此被選為分析模型。本方法中,通過抗體-抗原-磁納米探針復合物的形成引入一級條碼鏈;通過一級條碼鏈觸發(fā)的多分枝HCR反應產(chǎn)生二級條碼鏈;通過二級條碼鏈捕獲熒光探針,產(chǎn)生熒光;通過分別清點熒光點的數(shù)目,對目標物進行定量,實現(xiàn)了 IFN-y和TNF-a的同時、靈敏檢測,檢測限均為5fM。本方法中的條碼策略與經(jīng)典的條碼分析方法不同,無需對條碼鏈進行解離和再固定,避免了條碼鏈的損失和交叉雜交。此外,我們利用該方法對人血漿中的IFN-y和TNF-α進行了同時定量,說明該方法在疾病的早期臨床診斷中具有較大的應用潛力。第五章,構建了一個結合誘導的切刻酶位點重構策略,用于活細胞表面膜蛋白的定量分析。本方法中,首先,我們設計了一個含有適體序列、觸發(fā)序列和切刻酶識別位點的適體探針;沒有目標物時,適體探針以發(fā)夾結構的形式存在,此時,切刻酶識別位點的兩段互補序列相互分離,因而不能被切刻酶識別和切割;有目標物時,適體探針與目標物結合綁定誘導探針發(fā)生構象轉變,同時使切刻酶識別位點發(fā)生重構,觸發(fā)序列暴露;接著,切刻酶識別該位點并進行切割反應,釋放觸發(fā)序列;最后,游離的觸發(fā)序列在均相條件下觸發(fā)級聯(lián)的RCA和HCR反應,生成一條含有多個G-四倍體結構的多分枝DNA聚合物,實現(xiàn)信號的級聯(lián)放大。本方法實現(xiàn)了 PTK7的超靈敏檢測,檢測限為0.3 fM。此外,本也實現(xiàn)了對活細胞表面PTK7的定量分析,并可區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞以及不同腫瘤細胞之間PTK7的表達差異,說明本方法為活細胞表面膜蛋白的定量檢測提供了一個可靠的手段。第六章為結論和展望部分,對本論文的研究成果進行了總結和展望。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R446.1
【部分圖文】：

除了直接富集信號分子，納米材料也可富集信號轉導分子，常用的信號轉導??分子是寡核苷酸序列，這是一種將蛋白質檢測轉化為ＤＮＡ檢測的信號擴増模式。??Ｍｉｒｋｉｎ課題組首次提出了蛋白質分析的生物條形碼策略５１，如圖１－２Ａ，首先，??在ＡｕＮＰｓ表面修飾檢測抗體和大量單鏈ＤＮＡ分子，同時在ＭＮＢｓ表面修飾捕??獲抗體；然后，通過抗原抗體的特異性結合作用形成ＡｕＮＰｓ－抗原－ＭＮＢｓ復合物，??利用磁分離技術將其分離后，將單鏈ＤＮＡ分子從ＡｕＮＰｓ上解離下來，并利用銀??４??

過在ＡｕＮＰｓ和ＭＮＢｓ上修飾不同的抗體和ＤＮＡ序列，實現(xiàn)了蛋白質的多重檢??測５２。Ｊｉａｎｇ課題組利用ＭＮＢｓ富集ＤＮＡ分子，也實現(xiàn)了蛋白質的靈敏檢測５３，??如圖１－２Ｂ，首先，構建檢測抗體和大量雙鏈ＤＮＡ分子修飾的磁納米探針，同時??將目標物固定在基底上；接著，通過抗原和抗體的免疫結合作用，將磁納米探針??固定在基底上，利用磁分離技術洗去多余探針；最后，在雙鏈ＤＮＡ分子中插入??熒光染料，實現(xiàn)熒光信號的擴增。該方法實現(xiàn)了人免疫球蛋白ＧＯｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ??ＧｌｇＧ）的靈敏檢測，檢測限為３．０?ｆＭ。在此基礎上，該課題組又分別引入雜交??鏈式反應（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ?ｃｈａｉｎ?ｒｅａｃｔｉｏｎ，?ＨＣＲ）和滾環(huán)擴增反應（Ｒｏｌｌｉｎｇ?ｃｉｒｃｌｅ??ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ），分別將檢測限降低至?１４?ａＭ３４?和?８．３?ａＭ５５。??（Ａ）??ｆ?＾?＾??Ｕ？ｎ〇ｆ？ｖｃｌ＊?ＭＰ）?Ｐｔｔｌｍ?ｆ?－ｔ／Ｊ－?＾?＾Ａｒ＾＇??Ｖ８?ｊＬ＿?＜３?ｏｎ?Ｗ＞ｔ??Ｘ?ｅ？?Ｈ？＊?ｔｅ＊?？ＣＫ４ｍ（?ＭＭｒｗｄ??Ｓ?＞？＜？？■?Ｗｏ、?Ｓｔｅｐｓ??ＪＪｉＬ．??冬．ＯＨ＊?／?，，?＇?＇?二邊．．??Ｖ－一＾一？一?／?二．??Ｕ?（ＵＫ?？＜０＊＊＞?＃？？？?Ｗ??碰?Ｍ?

有利于信號的檢出。因此，作為一種新型熒光探針，ＱＤｓ被廣泛用于蛋白??質的靈敏檢測。Ｚｈｅｎｇ課題組利用ＱＤｓ表面帶負電和朊蛋白表面帶正電的性質，??將ＱＤｓ用于朊蛋白的檢測６５，原理見圖１－３，在ＱＤｓ過量的情況下，ＱＤｓ與朊??蛋白靜電結合，形成龐大的ＱＤｓ－阮蛋白聚合物，改變ＱＤｓ的熒光特性，通過測??定熒光信號進行定量。Ｘｕ課題組利用不同尺寸ＱＤｓ熒光光譜不同的特點，構建??了一個蛋白質多重分析方法６６，該方法構建了?ＱＤｓ標記的檢測抗體，利用抗體－??抗原的特異性結合作用，實現(xiàn)了?５種目標物的同時檢測。Ｌｉｕ等以ＱＤｓ為熒光標??記構建了一個磁球微陣列，實現(xiàn)了肺癌標志物ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１－１和ＮＳＥ的靈敏??檢測，檢測限分別為?０．１９?ｎｇ／ｍＬ、０．９７?ｎｇ／ｍＬ?和?０．３７?ｎｇ／ｍＬ６７。??？?＊?？?＿??－?＊?．ｍｔ＊．?＊??－．、Ｔ＇??？＇?ｍｆ?ｉｍ??圖１－３?ＱＤｓ用于蛋白質的靈敏檢測６５??金納米顆粒（ＡｕＮＰｓ）是一種直徑在ｌ￣１００ｎｍ之間的微小金顆粒，具有較??高的電子密度和介電特性
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 張華金 ,李娜 ,杜學志;干擾素的劑型及臨床應用[J];華西藥學雜志;2004年01期

2 李巖,邵念鵬,彭玉麟;γ干擾素的研究與臨床應用(綜述)[J];河北省科學院學報;2001年03期

本文編號：2875092