目的:基因治療從基因的根源出發(fā),是將治療型基因藥物輸送到靶細(xì)胞或細(xì)胞中特定靶點(diǎn)從而來更改基因表達(dá),以治療疾病的方法,由于高療效與低毒副的特點(diǎn),可成為治療腫瘤等基因疾病的理想方法。但基因治療臨床受限于安全高效的基因載體。本研究目的在于設(shè)計(jì)一種安全高效的非病毒載體,搭載核酸藥物,構(gòu)建基因傳送系統(tǒng)用于治療結(jié)腸癌,為結(jié)腸癌的基因治療提供新的研究思路。方法:以生物相容性良好的小分子量聚乙烯亞胺(Polyethylenimine 5000,PEI_(5K))為骨架,通過異硫氰酸酯甘露糖苷(MPITC)的異硫氰酸酯基團(tuán)與小分子量聚乙烯亞胺上的氨基反應(yīng),合成Man-PEI_(5K),繼而通過Man-PEI_(5K)上的氨基與低分子量魚精蛋白的巰基進(jìn)行反應(yīng),合成載體材料Man-PEI_(5K) CPP。該載體具有較強(qiáng)的正電荷,可通過靜電作用搭載核酸藥物,形成基因傳遞系統(tǒng)Man-PEI_(5K) CPP/pDNA,采用馬爾文激光粒度儀測定該系統(tǒng)的粒徑及電位,并用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察該傳遞系統(tǒng)的形態(tài)。在基因系統(tǒng)的體外評(píng)價(jià)部分,首先進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)考察腫瘤細(xì)胞對(duì)基因系統(tǒng)的攝取能力和該基因系統(tǒng)的穿透能力;通過細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)考察載體材料本身的毒性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷效果;通過Western Blot技術(shù)考察腫瘤細(xì)胞上治療基因的蛋白表達(dá)情況;通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)考察該載體的基因轉(zhuǎn)染效果。體內(nèi)評(píng)價(jià)部分,建立荷人源結(jié)腸癌移植瘤的裸鼠模型,采用體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)考察基因系統(tǒng)在體內(nèi)的分布情況。通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)考察系統(tǒng)的抗腫瘤效果,并對(duì)基因傳遞系統(tǒng)的生物安全性作了評(píng)價(jià)。成果與結(jié)論:我們發(fā)現(xiàn)甘露糖受體(Mannose receptor,MR)除在巨噬細(xì)胞和肝臟部位表達(dá)外,在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116也高表達(dá),故本文的第二章以生物相容性良好的聚乙烯亞胺5000(Polyethylenimine 5000,PEI_(5K))為骨架,為了提高基因傳遞系統(tǒng)的靶向性與穿膜能力,我們?cè)诨蜉d體上修飾了甘露糖受體的配體甘露糖和穿膜肽。反應(yīng)具體為:通過異硫氰酸酯甘露糖苷(α-D-Mannopyranosylphenyl isothiocyanate,MPITC)的異硫氰酸酯基團(tuán)與PEI_(5K)上的氨基反應(yīng),合成Man-PEI_(5K),接著Man-PEI_(5K)上的剩余氨基與低分子量魚精蛋白(Low Molecular Weight Protamine,LMWP)的巰基進(jìn)行反應(yīng),合成載體材料甘露糖-低分子量聚乙烯亞胺-穿膜肽(Man-PEI_(5K)-CPP)。并通過傅立葉紅外光譜和核磁共振氫譜對(duì)于該載體材料進(jìn)行表征。構(gòu)建質(zhì)粒DNA,用Man-PEI_(5K)-CPP搭載pDNA,從而成功構(gòu)建一種新型的甘露糖及穿膜肽修飾的基因傳遞系統(tǒng)Man-PEI_(5K)-CPP/pDNA。這一系統(tǒng)為帶正電荷的均一分散的球形納米粒。我們以腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)作為模型核酸藥物,構(gòu)建基因傳遞系統(tǒng)Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL,這一體系可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,但不會(huì)誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡。PEI_(25K)是一個(gè)常用的非病毒載體,為基因轉(zhuǎn)染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”,然而其載體本身的毒性大,用人源胚胎腎細(xì)胞(human embryonic kidney 293T cells,HEK293T)先考察載體材料Man-PEI_(5K)-CPP自身的毒性,發(fā)現(xiàn)其自身毒性小于PEI_(25K)。而后以PEI_(25K)/pTRAIL作為陽性對(duì)照,通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)以及Western Blot檢測Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的抗腫瘤效果,發(fā)現(xiàn)Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的體外抗腫瘤效果優(yōu)于PEI_(25K)/pTRAIL。采用YoYo-1標(biāo)記質(zhì)粒DNA,通過細(xì)胞攝取和體外腫瘤球穿透實(shí)驗(yàn)考察該基因傳遞系統(tǒng)的靶向和穿透效果。從上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Man-PEI_(5K)-CPP/pEGFP的轉(zhuǎn)染,攝取,腫瘤球穿透效果均優(yōu)于PEI_(25K)/pEGFP。采用增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)作為報(bào)告基因,發(fā)現(xiàn)雙修飾系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率最高。盡管體外實(shí)驗(yàn)PEI_(25K)的轉(zhuǎn)染效率高,但其體內(nèi)效果卻差強(qiáng)人意。因此對(duì)于體外轉(zhuǎn)染效果良好的基因傳遞系統(tǒng)的相應(yīng)體內(nèi)評(píng)價(jià)十分重要。本文建立了荷人源結(jié)腸癌移植瘤裸鼠模型,考察了Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的體內(nèi)分布情況和藥效,并對(duì)其體內(nèi)毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間和靶向腫瘤部位的效果優(yōu)于PEI_(25K)/pTRAIL。藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL具有良好的體內(nèi)抑瘤效果,且體內(nèi)毒性較小。綜上,我們構(gòu)建的Man-PEI_(5K)-CPP/pDNA具有良好的抑瘤效果,能為為結(jié)腸癌治療提供了一個(gè)新思路。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.35;R450
【部分圖文】：

1.1 基因治療的概述1.1.1 基因治療的概念及發(fā)展1968 年基因治療的概念首次被提出，基因治療是從基因根源著手，將治療基因安全有效地輸送至靶細(xì)胞，抵消或糾正故障基因?qū)C(jī)體造成的不良影響，以治療疾病[18]。廣義上講，如反義核酸技術(shù)[19]和 DNA 疫苗[20]等與分子生物學(xué)相關(guān)的方法也可視為基因治療。1989 年美國批準(zhǔn)了世界首個(gè)關(guān)于基因治療的臨床方案[18]。1990 年世界上第一個(gè)真正意義上的基因治療的臨床試驗(yàn)展開[21]。2000 年，法國巴黎內(nèi)克爾兒童醫(yī)院開展了 X 染色體相關(guān)聯(lián)的重癥聯(lián)合免疫缺陷病的基因治療臨床試驗(yàn)[22]。而目前我國已有 3 項(xiàng)基因治療新藥方案經(jīng)我國國家食品藥品監(jiān)管局（SFDA）批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[23]。據(jù) Wiley 統(tǒng)計(jì)，截止至 2017 年 4 月臨床基因治療的病例中，用于治療癌癥相關(guān)疾病占比 64.6%（見圖 1.1）[24]。

聲波介導(dǎo)）、化學(xué)方法（通過人工合成的化學(xué)物質(zhì)如脂質(zhì)體和陽離子聚合物介）和生物方法（以病毒載體如慢病毒和腺病毒導(dǎo)入 DNA）。其中，化學(xué)方法和物方法實(shí)現(xiàn)成功的基因治療都依賴于高效的基因傳輸載體來搭載基因藥物，所獲得合適的基因載體，是基因治療的關(guān)鍵。1.1.3 基因載體的分類基因載體，是基因藥物的運(yùn)輸工具，是它的搭載體系。主要分為病毒類載體非病毒類載體[26, 27]。在基因遞送過程中，如果沒有載體的保護(hù)，裸 DNA 極易降解。所以有效、低毒的基因載體對(duì)于基因治療十分必要。1.1.3.1 病毒類載體病毒類載體轉(zhuǎn)染效率高，截止至 2017 年，約有 67%的基因治療臨床試驗(yàn)均用病毒載體（圖 1.2）。病毒類載體分為 DNA 類病毒載體和 RNA 類病毒載體[24]。

圖 1.3 各種不同結(jié)構(gòu)的非病毒載體與基因的復(fù)合物[50]（1） 磷酸鈣磷酸鈣是最早的 DNA 轉(zhuǎn)染材料之一，是一種天然的生物材料，可以與 DNA 混共沉淀成納米顆粒，且自身具有良好的生物安全性和可降解性[51]。但有觀點(diǎn)認(rèn)為種納米顆粒會(huì)提早釋放DNA，使DNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)困難，不能進(jìn)入細(xì)胞核[52]。且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，納米粒的尺寸也增加，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率不高[53]。（2） 陽離子脂質(zhì)體陽離子脂質(zhì)體由疏水基團(tuán)、連接臂、親水性陽離子頭基三部分組成。其中疏水鏈的長度和轉(zhuǎn)染效率有關(guān)[54, 55]，而其連接臂會(huì)影響陽離子脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和生物解性[56]，復(fù)合物膜融合的程度受到親水性陽離子頭基的水和程度影響[57]。陽離子質(zhì)體作為基因載體的優(yōu)點(diǎn)是其具有類細(xì)胞膜特性，在轉(zhuǎn)染時(shí)基因的生物學(xué)活性不破壞。但陽離子脂質(zhì)體存在臨床試驗(yàn)效率低（在壓縮 DNA 方面效率低）和毒性問題。（3） 陽離子聚合物[58

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 鄧洪新;魏于全;;腫瘤基因治療的研究現(xiàn)狀和展望[J];中國腫瘤生物治療雜志;2015年02期

2 馬俊麗;曾珊;;錯(cuò)配修復(fù)基因和結(jié)腸癌的關(guān)系[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年02期

3 劉嘉;劉漢清;;非病毒基因載體聚合物的研究進(jìn)展[J];中國生化藥物雜志;2011年01期

4 呂強(qiáng);邢沈陽;趙志輝;張西臣;李建華;宮鵬濤;;結(jié)腸癌的研究現(xiàn)狀及展望[J];中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2009年08期

5 康焱;廖威明;盛璞義;張瓏涓;原向偉;雷磊;黃保丁;;腺相關(guān)病毒介導(dǎo)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7基因體外轉(zhuǎn)染脂肪源性干細(xì)胞的研究[J];中華創(chuàng)傷骨科雜志;2006年11期

6 徐小良,戴\戎,湯亭亭,嚴(yán)孟寧,朱振安,郁朝鋒,徐e

本文編號(hào)：2834167