目的:構(gòu)建以慢病毒為載體的酪氨酸酶(TYR)報(bào)告基因,轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),并篩選混合克隆,探討TYR報(bào)告基因細(xì)胞水平的光聲成像(photoacoustic imaging,PAI)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、以及正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography,PET)的可行性。方法:提取SD大鼠股骨骨髓細(xì)胞,采用貼壁培養(yǎng)法純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCS),流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞特異性抗體CD45和CD90,CD31和CD44。構(gòu)建以慢病毒為載體的TYR報(bào)告基因(Lentiviral TYR,LV-TYR)并轉(zhuǎn)染MSCs(MOI=3),嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的混合克隆(TYR-MSCs)作為實(shí)驗(yàn)組,正常MSCs作為陰性對(duì)照組。應(yīng)用Western Blot(WB)、酶標(biāo)儀吸光度檢測(cè)法、黑色素Masson-Fontana染色檢測(cè)各組細(xì)胞目的基因TYR的表達(dá)。比較不同組、不同濃度細(xì)胞的PAI以及MRI成像結(jié)果。制備黑色素特異性探針18F-5-氟-N-(2-(二乙氨基)乙基)吡啶甲酰胺(18F-5-fluoro-N-(2-(Diethylamino)ethyl)picolinamid,18F-5-FPN),對(duì)不同組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝取和阻斷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:成功提取并純化SD大鼠MSCs,流式細(xì)胞鑒定CD90和CD44陽(yáng)性,CD45和CD31陰性。LV-TYR成功轉(zhuǎn)染MSCs,嘌呤霉素篩選混合克隆。Western Blot、酶標(biāo)儀吸光度檢測(cè)法、黑色素Masson-Fontana染色顯示TYR-MSCs能表達(dá)目的基因TYR,而MSCs無(wú)TYR表達(dá)。TYR-MSCs組有明顯的PAI信號(hào),加酪氨酸(tyrosine)預(yù)處理的TYR-MSCs的PAI信號(hào)較未預(yù)處理的TYR-MSCs信號(hào)強(qiáng)。MRI細(xì)胞顯像顯示加三氯化鐵(FeCl3)或Tyrosine預(yù)處理的TYR-MSCs顯示了較高的T1信號(hào),且信號(hào)的強(qiáng)度隨細(xì)胞濃度的增加而增加。同時(shí)加FeCl3和Tyrosine的TYR-MSCs組T1信號(hào)最強(qiáng)。加FeCl3的MSCs組T1信號(hào)有輕度增加。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TYR-MSCs對(duì)18F-5-FPN的攝取在60min時(shí)最高,細(xì)胞攝取值為7.86±0.85%(n=3),阻斷實(shí)驗(yàn)表明,19F-5-FPN能阻斷細(xì)胞攝取18F-5-FPN。結(jié)論:本研究通過(guò)慢病毒為載體轉(zhuǎn)染TYR報(bào)告基因至大鼠MSCs并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TYR的MSCs細(xì)胞系。通過(guò)對(duì)TYR-MSCs進(jìn)行PAI、MRI顯像以及核素細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn),從體外細(xì)胞水平證實(shí)轉(zhuǎn)染TYR的MSCs可以進(jìn)行多模態(tài)顯像,為干細(xì)胞在體示蹤提供了理論基礎(chǔ)。目的:探索應(yīng)用TYR單一報(bào)告基因進(jìn)行在體正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography,PET)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、以及光聲成像(photoacoustic imaging,PAI)以監(jiān)測(cè)心肌梗死模型干細(xì)胞移植的可行性。方法:采用左側(cè)開(kāi)胸結(jié)扎SD大鼠左冠狀動(dòng)脈建立永久性心梗模型,結(jié)扎后半小時(shí)在心梗區(qū)周?chē)⑸浯笫髷y帶TYR報(bào)告基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(TYR-MSCs),以相同方法注射未轉(zhuǎn)染的MSCs作為對(duì)照組。72 h后處死部分大鼠行心肌細(xì)胞HE染色以及心臟TTC染色。當(dāng)天、第6 d、第13 d、第20 d、第27 d行18F-FDG心肌代謝顯像鑒定建模成功率。建模后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d行18F-5-FPN探針的PET成像、MRI成像以及光聲成像活體示蹤干細(xì)胞。結(jié)果:結(jié)扎冠脈法建模成功率為70%,HE染色可見(jiàn)心梗區(qū)域心肌細(xì)胞壞死、水腫、變性、空泡形成、心肌纖維斷裂以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等。正常心肌細(xì)胞排列整齊,血管豐富。TTC染色可見(jiàn)梗死區(qū)域心肌呈白色,平均梗死面積為38.1%±7.3%(n=3)。18F-FDG心肌代謝顯像可見(jiàn)心梗區(qū)域有放射性分布缺損。18F-5-FPN PET成像可見(jiàn)干細(xì)胞移植區(qū)有明顯局限放射性分布濃聚,其隨時(shí)間延長(zhǎng)放射性分布輕度減低,第1d至第28d從1.78±0.22%ID/g下降至1.62±0.13%ID/g(n=8),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。MRI顯像T2*WI序列成像可見(jiàn)干細(xì)胞移植區(qū)信號(hào)減低,心梗區(qū)域和周?chē)Ｐ募〉膶?duì)比度逐漸增加,第1 d至第28 d對(duì)比度從59.18±4.9增加至80.5±8.8(n=8),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。光聲成像可見(jiàn)干細(xì)胞移植區(qū)明顯光聲信號(hào),但是信號(hào)值第1 d至第28 d從472.6±48.1下降至283.4±49.2,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:TYR報(bào)告基因可用于活體PET、MRI和PAI多模態(tài)顯像以示蹤干細(xì)胞,在體顯像顯示移植了TYR-MSCs的大鼠心梗區(qū)域在28 d內(nèi)均有PET、MRI、PAI信號(hào)。但MRI信號(hào)和PAI信號(hào)隨時(shí)間衰減明顯,PET信號(hào)衰減不明顯。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R542.22;R445.2
【部分圖文】：

圖 1：酪氨酸酶的催化反應(yīng)以及催化產(chǎn)物黑色素用于多模態(tài)顯像的原理急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是指因持久和嚴(yán)重的心肌缺引起的部分心肌急性壞死，是一類(lèi)患病率及死亡率均較高的缺血性心臟病。其病理改變主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死、凋亡細(xì)胞數(shù)增加、心肌細(xì)胞纖維化、瘢痕形成。隨著病變的進(jìn)展，逐步出現(xiàn)心室重構(gòu)、心臟擴(kuò)大、心臟收縮功能減低、最終導(dǎo)致心臟功能衰竭[28]。目前急性心肌梗死常見(jiàn)治療手段包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（GABG），但這些治療手段只能挽救瀕死的心肌，對(duì)已死亡的心肌細(xì)胞沒(méi)有治療作用[29]。目前心肌梗死治療的主要困難在于心肌細(xì)胞再生和血管重建。近年來(lái)的研究表明，具有再生潛能的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，尤其是體細(xì)胞來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）為心肌再生提供了一種可能[30]Takuya Narita[31]的統(tǒng)計(jì)表明，在一系列干細(xì)胞治療心力衰竭動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)上，已有 40 余項(xiàng)干細(xì)胞治療心力衰竭的臨床實(shí)驗(yàn)獲得注冊(cè)。目前已完成的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果

17圖 2：載體 GV341 圖譜用DNA連接酶連接載體和TYR基因，將TYR基因克隆到載體中。用熱休克法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E1Coli DH5α，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩落。接入800 μL溶湯肉菌（LB）培養(yǎng)基中37℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。PCR法、酶切法篩選正確的重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定載體構(gòu)建完全正確

圖 3：病毒液濾過(guò)收集置于轉(zhuǎn)頭上在4000 g離心10~15 min，得到濃縮，取出離心裝置，分離過(guò)濾杯和濾過(guò)液收集杯于1000 g的離心力離心2 min，樣品收集杯中的圖 4：病毒液濃縮液移至病毒管中，-80 °C長(zhǎng)期保持，并進(jìn)行病檢測(cè)病毒滴度

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李瀟;金征宇;王怡寧;;報(bào)告基因標(biāo)記在干細(xì)胞治療急性心肌梗死中的應(yīng)用進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2015年05期

2 苗少峰;楊虹;黃遠(yuǎn)輝;宮睿;邵曉鵬;畢祥麗;;光聲成像研究進(jìn)展[J];中國(guó)光學(xué);2015年05期

3 王曉馳;常剛;曹瑞軍;孟令杰;;近紅外熒光染料的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及生物熒光成像應(yīng)用[J];化學(xué)進(jìn)展;2015年07期

4 王榮福;;核醫(yī)學(xué)分子靶向診斷與治療[J];腫瘤學(xué)雜志;2014年11期

5 趙富寬;張波;;PET/MRI研制及應(yīng)用進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)療設(shè)備;2014年08期

6 王春麗;柳偉;;酪氨酸酶的研究進(jìn)展[J];生物加工過(guò)程;2014年04期

7 蘭小鵬;;適配體技術(shù)在分子影像學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J];功能與分子醫(yī)學(xué)影像學(xué)(電子版);2014年01期

8 徐思慧;宋春敬;潘曄;;腺病毒載體與慢病毒載體感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的比較[J];生命科學(xué)研究;2013年06期

9 趙焱昭;姚琦;吳冰;譚輝;鄔鵬躍;張春富;程登峰;石洪成;;~(125)I-USPIO-bevacizumab用于肝細(xì)胞肝癌的SPECT/CT/MRI多模態(tài)顯像研究[J];中國(guó)臨床醫(yī)學(xué);2013年06期

10 楊國(guó)仁;;關(guān)于SPECT/CT的優(yōu)勢(shì)及選型相關(guān)問(wèn)題初探[J];中國(guó)醫(yī)療器械信息;2013年10期

本文編號(hào)：2825027