【摘要】：鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)已成為引起醫(yī)療相關(guān)性腦膜炎的重要革蘭陰性菌,特別是在神經(jīng)外科的手術(shù)病人中。碳青霉烯類(lèi)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的出現(xiàn)并在世界范圍內(nèi)快速播散及廣泛流行,使得鮑曼不動(dòng)桿菌腦膜炎治療中可供選擇的抗生素十分有限,同時(shí)許多藥物難以透過(guò)血腦屏障,因此鮑曼不動(dòng)桿菌腦膜炎的治療成為臨床面臨的巨大難題。盡管目前已有大量鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)的分子流行病學(xué)調(diào)查,但菌株來(lái)源往往以呼吸道和血流為主,腦脊液分離菌株的分子流行病學(xué)特征研究仍然缺乏。腦脊液來(lái)源菌株和其他來(lái)源菌株之間的比較研究則更為少見(jiàn)。因此我們開(kāi)展了本研究,在為鮑曼不動(dòng)桿菌腦膜炎的臨床治療和防控提供有力依據(jù)的同時(shí),探索不同分離來(lái)源菌株間是否存在遺傳背景的差異,以便更加精準(zhǔn)地治療鮑曼不動(dòng)桿菌引起的各種不同類(lèi)型的感染。鮑曼不動(dòng)桿菌在導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時(shí)受到獨(dú)特的腦脊液環(huán)境壓力,其在腦脊液中的生長(zhǎng)適應(yīng)機(jī)制為鮑曼不動(dòng)桿菌引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病機(jī)制提供了線索,也為疾病的治療提供了潛在靶點(diǎn)。本研究的第一章,通過(guò)收集上海及浙江多家醫(yī)院在2013年4月-2016年11月間腦脊液來(lái)源的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株54株,以及同期分離的血流來(lái)源菌株21株,對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE),全基因組測(cè)序,MLST和cgMLST分型以及泛基因組關(guān)聯(lián)分析研究。研究結(jié)果顯示腦脊液分離得到的鮑曼不動(dòng)桿菌中94.4%是CRAB菌株,并且對(duì)美羅培南的MIC值均在32μg/mL以上。同時(shí)這些菌株對(duì)除外替加環(huán)素和多粘菌素的其他種類(lèi)抗生素的耐藥率也均在90%以上,有1/6左右的腦脊液分離株對(duì)替加環(huán)素不敏感。所有菌株目前對(duì)多粘菌素仍保持100%的敏感率。21株血流分離株在耐藥表型上和腦脊液分離株無(wú)明顯差異。納入研究的所有54株腦脊液分離株可分為10個(gè)已知的ST型以及4個(gè)新ST型。ST195是最常見(jiàn)的ST型,占了腦脊液分離株菌株的35.2%(n=19)。ST195菌株在血流來(lái)源菌株中也占首位,其次為ST208。54株腦脊液分離鮑曼不動(dòng)桿菌中有50株細(xì)菌屬于國(guó)內(nèi)流行的CC92克隆復(fù)合體。3株非CC92克隆復(fù)合體的菌株分離自神經(jīng)外科病人,提示神經(jīng)外科分離的鮑曼不動(dòng)桿菌遺傳背景更具多樣性。blaOXA-23基因是腦脊液分離菌株中唯一檢測(cè)到的獲得性碳青霉烯酶耐藥基因。除了鮑曼不動(dòng)桿菌中常見(jiàn)的β內(nèi)酰胺酶(ADC,TEM-1D等)外,還檢測(cè)到3株腦脊液分離株攜帶編碼CTX-M-55型的β-內(nèi)酰胺酶基因,其中的2株還共同攜帶有磷霉素耐藥基因fosA。PFGE的結(jié)果顯示屬于CC92克隆復(fù)合體的菌株具有高度的同源性。通過(guò)cgMLST分型,可觀察到在研究期間多克隆來(lái)源的菌株在院內(nèi)播散流行,導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌腦膜炎的發(fā)生。某些不同醫(yī)院內(nèi)腦脊液分離得到的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株間也具有高度相似的遺傳背景,提示了鮑曼不動(dòng)桿菌存在院際之間克隆傳播的可能。腦脊液分離株和血流分離株之間遺傳背景也高度相似,血流分離菌株在耐藥表型、耐藥基因分布、ST分型、PFGE聚類(lèi)分析以及cgMLST分型及泛基因組關(guān)聯(lián)分析中均未顯示出和腦脊液來(lái)源的菌株有明顯差異。另外我們還證實(shí)了 cgMLST分型較傳統(tǒng)的PFGE和MLST分型方法具有更高的分辨率和準(zhǔn)確性。本研究的第二章,從上一部分研究的腦脊液分離菌株中選擇了一株最常見(jiàn)的ST195型菌株C25,在體外進(jìn)行了該菌株人腦脊液中生長(zhǎng)的全局轉(zhuǎn)錄組研究。研究顯示,在腦脊液中生長(zhǎng)時(shí)C25菌株中有1551個(gè)基因較其在LB肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)發(fā)生了差異表達(dá)(log2 | Fold change | ≥1,false discovery rate,FDR p≤0.001),大約占了 C25全基因組基因的2/5。其中有794個(gè)基因表達(dá)下調(diào),757個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。通過(guò)直系同源群COG富集分析顯示發(fā)生表達(dá)下調(diào)的基因主要富集在COG分類(lèi)中J類(lèi)(翻譯和核糖體功能)和U類(lèi)(細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸)中。而表達(dá)上調(diào)的基因僅在S(未知功能類(lèi))和K(轉(zhuǎn)錄)兩個(gè)分類(lèi)中發(fā)生了富集。以上結(jié)果顯示了在體外腦脊液環(huán)境中鮑曼不動(dòng)桿菌C25的低生長(zhǎng)和生物合成狀態(tài)。一些已知的鮑曼不動(dòng)桿菌毒力因子在腦脊液組中也發(fā)生差異表達(dá)。其中鐵攝取相關(guān)基因,包括兩組嗜鐵素基因簇和血紅素利用相關(guān)的基因簇表達(dá)上調(diào);和生物被膜形成相關(guān)的AdeFGH外排泵和群體感應(yīng)系統(tǒng)的abaI基因表達(dá)也有上調(diào)。針對(duì)鐵合成和生物被膜形成相關(guān)通路可能可以作為鮑曼不動(dòng)桿菌腦膜炎治療的潛在靶點(diǎn)。而表達(dá)明顯下調(diào)的基因主要集中在一些膜孔蛋白基因(ompA,ompW和carO)和部分脂多糖合成的基因以及莢膜生物合成基因中。以上變化反應(yīng)了鮑曼不動(dòng)桿菌在腦脊液乏鐵環(huán)境下的獨(dú)特適應(yīng)性變化。莢膜,脂多糖以及外膜蛋白等細(xì)胞表面毒力因子的表達(dá)下調(diào)也反應(yīng)了細(xì)菌在腦脊液環(huán)境中細(xì)胞膜生物合成受限。體外腦脊液環(huán)境并不利于鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)。綜上所述,本研究明確了華東地區(qū)5家醫(yī)院腦脊液分離鮑曼不動(dòng)桿菌的分子流行病特征,并利用cgMLST分型的方法明確了鮑曼不動(dòng)桿菌在導(dǎo)致醫(yī)療相關(guān)性腦膜炎發(fā)生時(shí)多克隆來(lái)源菌株的院內(nèi)感染傳播模式。腦脊液分離菌株和同期血流感染分離菌株在遺傳背景上無(wú)顯著差異。同時(shí)我們首次進(jìn)行了鮑曼不動(dòng)桿菌臨床菌株在體外人腦脊液中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,得到了其在體外人腦脊液中生長(zhǎng)的全局轉(zhuǎn)錄組學(xué)特點(diǎn)和已知毒力因子基因的差異表達(dá)變化規(guī)律。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R742.9;R446.14
【圖文】：

曼不動(dòng)桿菌中５１株對(duì)美羅培南耐藥，同時(shí)這５１株ＣＲＡＢ菌株對(duì)哌拉西林／他唑逡逑巴坦、頭孢哌酮／舒巴坦、左氧氟沙星、頭孢他啶、頭孢吡肟、四環(huán)素、慶大霉逡逑素的耐藥率均在９０％以上（圖１．邋１）。另外有１株腦脊液分離菌株對(duì)替加環(huán)素耐藥逡逑（ＭＩＣ邋＝邋４ｎｇ／ｍＬ），９株為替加環(huán)素中介菌株，其余４４株對(duì)替加環(huán)素敏。所有腦逡逑脊液分離株對(duì)多粘菌素的敏感率為１００％。而同期血流分離菌株的抗生素敏感性試逡逑驗(yàn)和腦脊液組細(xì)菌相近（附表１．３）。逡逑值得注意的是，所有ＣＲＡＢ菌株的美羅培南ＭＩＣ值均在３２邋ｐｇ／ｍＬ以上，且逡逑超過(guò)三分之一的菌株的美羅培南ＭＩＣ值大于等于１２８邋ｐｇ／ｍＬ。另有３株腦脊液分逡逑離株和１株血液分離株對(duì)美羅培南敏感，它們對(duì)其他類(lèi)別抗生素均保持良好的敏逡逑＿敏感■中介■耐藥逡逑替加環(huán)索逡逑ＲＸ９９邐４６邐＿逡逑四環(huán)索Ｂｆｃｉ邐４９逡逑頭孢毗肟Ｄｈ邐５０邐｜逡逑頭ｍ他啶５0邐0逡逑左氧ｍ沙ｓ邋Ｅｌ逡逑關(guān)羅培南Ｄ邐５１邐0逡逑頭孢哌酮／舒巴坦４９邐｜逡逑懪拉西林／他畦巴坦０邐５１邐０逡逑圖１．１腦脊液分離鮑曼不動(dòng)桿菌菌株藥敏結(jié)果逡逑感性。逡逑１３逡逑

（ｈｔｔｐ：／／ｅｂｕｒｓｔ．ｍｌｓｔ．ｎｅｔ／）按照默認(rèn)參數(shù)選項(xiàng)（７個(gè)管家基因中有６個(gè)一致并且菌株逡逑數(shù)目大于３為定義為一個(gè)克隆復(fù)合體ｃｌｏｎａｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，邋ＣＣ）邋，邋５０個(gè)腦脊液分離菌逡逑株被劃為一個(gè)克隆復(fù)合體（圖１．２），其中２株是目前尚未定義的新ＳＴ型，均為逡逑ＳＴ５４０的單位點(diǎn)變異型（Ｓｉｎｇｌｅ邋ｌｏｃｕｓ邋ｖａｒｉａｎｔ，ＳＬＶ），在本研究中將其命名為ＮＴ５４０．１逡逑１４逡逑

所有７５株細(xì)菌拼接完成的基因俎草圖上傳至ＣＧＥ網(wǎng)站（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ逡逑／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＲｅｓＦｉｎｄｅｒ－２．１／）利用ＲｅｓＦｉｎｅｒ數(shù)據(jù)庫(kù)工具比對(duì)，菌株獲得性耐藥基因的分逡逑布可見(jiàn)圖１．３。鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥性的主要機(jī)制包括產(chǎn)碳青逡逑霉烯酶、膜孔蛋白突變、外排泵高表達(dá)等，其中以產(chǎn)Ｄ類(lèi)碳青霉烯酶苯唑西林酶逡逑（ＯＸＡ型碳青霉烯酶）這一機(jī)制最為重要�；蚴悄X脊液分離株中所有逡逑ＣＲＡＢ菌株中唯一被檢測(cè)到的獲得性碳青霉烯酶耐藥基因。其他常見(jiàn)的獲得性逡逑ＯＸＡ型碳青霉博酶耐藥基因如以及金屬酶基逡逑因均未被檢測(cè)到。在所有腦脊液分離株中均檢測(cè)到定位于鮑曼不動(dòng)桿菌染色體上逡逑的基因，其中以基因占絕大多數(shù)，和之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致，編逡逑碼ＯＸＡ－６６型破青霉q婷傅木昃粲諗分蘅寺∑紫擔(dān)桑懾澹ǎ牛酰潁錚穡澹幔鑠澹悖歟錚睿幔戾澹歟椋睿澹幔紓澹簀義希桑桑�，也就是用劗峨sΦ模茫茫梗部寺「春咸澹郟玻梗蕁＃粗攴牽茫茫梗部寺「春咸宓哪約掛哄義戲擲脛曇觳獾攪隋澹粗植煌模祝媯歟錚恚緇潁直鴇嗦耄希兀粒叮矗希兀粒叮罰希兀粒叮�，辶x希希兀粒保玻靶吞記嗝瓜┟浮Ｍ彼心約掛壕曛芯觳獾皆誆歡司糝兇畛＜義系謀嗦臚鋒呔孛傅幕潁簦常ǎ傘＃祝幔睿幕蛟冢常噸昴約掛悍擲脛曛斜誨義霞觳獾�。译E狹街鄭校邗０訪富虻母弒韽趾捅歡司氖姘吞鼓鴕┗潑芮繡義希保靛義

本文編號(hào)：2801411