【摘要】：第一部分基于先證者醫(yī)學(xué)外顯子組測序技術(shù)檢測分析DSD患者的致病基因變異目的:性發(fā)育障礙(Disorders of sex development,DSD)是一大類以染色體異常、性腺或解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育不典型為特征的異質(zhì)性疾病,大多數(shù)特定類型DSD發(fā)病率在1/100,000以下。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床確診率低。高通量測序技術(shù)憑借其大規(guī)模并行快速檢測的優(yōu)勢極大地提高了遺傳病的分子診斷效率。本研究旨在應(yīng)用先證者醫(yī)學(xué)外顯子組測序技術(shù)(proband-only medical exome sequencing,POMES)檢測中國DSD患者的基因變異,評估其在DSD診斷中的臨床應(yīng)用價值。方法:1.根據(jù)DSD納入及排除標(biāo)準(zhǔn),收集患者臨床資料并按染色體核型分類;2.采集患者及其家系成員的DNA樣本,對先證者行高通量測序,包括文庫建立、雜交、富集捕獲、上機(jī)測序等流程;3.根據(jù)測序深度等參數(shù)評估數(shù)據(jù)質(zhì)量,通過Ingenuity軟件對變異進(jìn)行篩選;4.候選基因變異應(yīng)用Sanger測序驗(yàn)證后按美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會指南評估致病性,并將數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.納入的88例先證者根據(jù)染色體核型分為46,XY DSD(68/88,77.3%)和46,XX DSD(20/88,22.7%),就診年齡以9~14歲最多見;2.測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾分析、驗(yàn)證后,47例患者檢測到候選變異(53.4%,47/88),以SRD5A2和AR基因變異最為常見;3.檢測到的54個變異中27個為新發(fā)現(xiàn)的變異,變異類型包括錯義、無義、移碼、剪接位點(diǎn)、閱讀框內(nèi)插入/缺失及拷貝數(shù)變異,其中致病性變異和可能致病性變異分類分別占44.4%(24/54)和25.9%(14/54);4.46,XY DSD和46,XX DSD的診斷率分別為45.6%(31/68)和20%(4/20)。結(jié)論:1.本部分研究統(tǒng)計(jì)了中國人群DSD患者的發(fā)病情況,豐富了中國人群罕見DSD的基因譜、突變譜以及表型譜;2.POMES技術(shù)結(jié)合規(guī)范化變異分類可作為46,XY DSD患者的臨床一線診斷策略。第二部分1型Leydig細(xì)胞發(fā)育不全患者的分子遺傳學(xué)分析目的:睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不全(Leydig cell hypoplasia,LCH)是46,XY DSD的罕見病因之一,由黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor,LHCGR)基因失活變異所引起。本部分研究旨在分析總結(jié)LCH患者的臨床資料及分子遺傳學(xué)特征。方法:1.收集并分析LCH先證者的臨床資料,檢測血清相關(guān)激素指標(biāo),行激素激發(fā)試驗(yàn)等;2.POMES技術(shù)結(jié)合Sanger測序分析驗(yàn)證患者基因組變異;3.應(yīng)用CRYP-SKIP和BDGP預(yù)測軟件并結(jié)合蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域,分析評估變異的致病性;4.對先證者手術(shù)切除后的異常性腺組織行病理學(xué)分析。結(jié)果:1.先證者的臨床特征主要表現(xiàn)為外生殖器外觀與染色體核型不符、腹股溝疝,伴有低水平血清基礎(chǔ)睪酮和雙氫睪酮且對絨毛膜促性腺激素激發(fā)無反應(yīng);2.基因檢測表明患者LHCGR基因存在兩個未被報道過的復(fù)合雜合變異,包括受體剪接位點(diǎn)變異c.681-1GA和移碼變異c.1582_1585del ATAT,p.Ile528*,分別遺傳自其父母;3.結(jié)合預(yù)測軟件及所在蛋白結(jié)構(gòu)域的位置分析,兩個變異可能分別通過選擇性剪接跳躍形成異常剪接產(chǎn)物,以及編碼提前終止而形成截短蛋白來影響受體的功能,均可歸類為致病性變異;4.先證者切除性腺的組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)睪丸結(jié)構(gòu)發(fā)育異常,符合LCH的診斷。結(jié)論:本部分研究報道了LHCGR基因上新發(fā)現(xiàn)的2個復(fù)合雜合變異,進(jìn)一步拓寬基因型與表型的相關(guān)性,分析了受體不同功能結(jié)構(gòu)域致病機(jī)理的差異。第三部分HFM1基因變異引起原發(fā)性卵巢功能不全致病機(jī)制的初步研究目的:原發(fā)性卵巢功能不全(Primary ovarian insufficiency,POI)是病因復(fù)雜的生殖系統(tǒng)疾病,減數(shù)分裂基因HFM1與POI發(fā)生相關(guān),然而其致病機(jī)制尚不明確。本部分研究擬以在POI患者中鑒定的HFM1錯義變異為切入點(diǎn),分析其可能的致病機(jī)理。方法:1.采用定點(diǎn)突變法在HFM1野生型質(zhì)�；A(chǔ)上構(gòu)建突變型表達(dá)載體,并將野生型和突變型HFM1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入HEK 293T細(xì)胞;2.收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提取總RNA,行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測m RNA水平的表達(dá)情況,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;3.提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白,行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測蛋白水平的表達(dá)情況;4.根據(jù)蛋白序列結(jié)合SWISS-MODEL、Py MOL等軟件構(gòu)建模擬的蛋白三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1.測序驗(yàn)證7個突變型(c.148、c.1241、c.2206、c.2325、c.2651、c.3367及c.3580)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;2.HFM1突變型與野生型質(zhì)粒在m RNA水平的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;3.HFM1突變型質(zhì)粒在HFM1蛋白表達(dá)水平上與野生型質(zhì)粒無明顯差異;4.基于蛋白結(jié)構(gòu)模型,變異p.His414Pro、p.Phe775Leu和p.Ile884Ser位于HFM1蛋白的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域,而p.Gly736Ser和p.Ser1123Pro則位于重要基序中。結(jié)論:1.本部分研究發(fā)現(xiàn)在人類POI疾病中已報道的HFM1基因錯義變異未影響體外HFM1蛋白的表達(dá),這些變異并非通過降低蛋白表達(dá)而致病;2.根據(jù)變異所在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的位置、氨基酸理化性質(zhì)的改變等,推測其致病機(jī)制可能是影響相關(guān)重要結(jié)構(gòu)域和基序而引起酶功能異常,為下一步深入研究提供了線索。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R440;R588
【圖文】：

圖 1. 胚胎期性發(fā)育示意圖（From Biason-LauberA, et al. “Ovarian development and disease: The known and theunexpected.”[10]）體在多種轉(zhuǎn)錄因子的作用н進(jìn) 步發(fā)育為睪丸或卵巢（性腺性別），其中最關(guān)鍵的是 Y 染色體т性別決定基因 SRY，聯(lián)合 SOX9、NR5A1 等轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)原始性腺向睪丸分化[13-15]，而 X 染色體т NR0B1 基因則抑制這 過程，у WNT4 信號因子等共同促進(jìn)向卵巢分化[16,17]；胚胎 7 周之后，固有的兩套原始生殖管道（中腎管和中腎旁管）在п同因子、激素作用н逐漸分化為男性或女性生殖器官。對于 46,XY 而言，睪丸 Sertoli 細(xì)胞分泌的抗苗勒管激素（anti-mullerianhormone,AMH）可激活 Smad 信號通路，刺激中腎旁管發(fā)生退化吸收，抑制其向輸卵管、子宮、陰道等女性內(nèi)生殖器官分化[10,18-19]，而睪丸 Leydig 細(xì)胞產(chǎn)生的睪酮則刺激中腎管發(fā)育為附睪、輸精管、射精管等男性內(nèi)生殖器結(jié)構(gòu)[5,12]；另 方面，

圖 2. 性分化的分子機(jī)制示意圖A. 原始性腺分化為睪丸或卵巢；B. 男性性分化；C. 女性性分化（From Rey R, et al. “Sexual Differentiation”[12]）新 代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）也稱高通量測序技術(shù)憑借其能快速、高通量地檢測人類基因組中所有基因或目標(biāo)區(qū)域基因的優(yōu)勢，極

2.4 88 例 DSD 患者及 POMES 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析如圖 3A 所示，88 例先證者根據(jù)染色體核型分為 46,XYDSD（68/88，77.3%）和 46,XXDSD（20/88，22.7%）。就診時年齡<1 歲的嬰幼兒患者 14 例，其中 46,XY 13 例，46, XX 1 例；1~5 歲幼兒期患者 11 例，其中 46, XY 9 例，46, XX 2例；5~9 歲兒童期（青春期前）14 例，其中 46,XY13 例，46,XX1 例；9~14 歲即青春早期患者最多，30 例，46,XY24 例，46,XX6 例；大于 14 歲即青春后期患者 19 例，其中 46, XY 9 例，46, XX 10 例（見圖 3B）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胥雨菲;王劍;;減數(shù)分裂基因致原發(fā)性卵巢功能不全的研究進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2017年02期

本文編號：2797068