發(fā)布時(shí)間：2020-08-14 11:16

【摘要】：目的1.通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)直接檢測血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中腸桿菌科細(xì)菌水解厄他培南的能力,從而快速篩查產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌。2.建立利用MALDI-TOF MS對(duì)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)進(jìn)行分型的方法,從而快速進(jìn)行CRKP醫(yī)院感染流行病學(xué)分析。3.利用MALDI-TOF MS篩選獲得ST11型產(chǎn)KPC-2碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的單個(gè)特異峰,快速篩查此類型別肺炎克雷伯菌,從而為臨床合理有效治療和院感控制提供依據(jù)。方法1.選取32株產(chǎn)碳青霉烯酶和32株不產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌用于模擬血培養(yǎng)陽性標(biāo)本,利用MALDI-TOF MS直接檢測此類模擬標(biāo)本中腸桿菌科細(xì)菌對(duì)厄他培南的水解能力,根據(jù)厄他培南及其水解產(chǎn)物質(zhì)量峰的強(qiáng)度計(jì)算logRQ值,并確定其cutoff值。收集385例已檢出腸桿菌科細(xì)菌的臨床血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行MALDI-TOF MS厄他培南水解試驗(yàn),并對(duì)水解試驗(yàn)陽性的菌株以及水解試驗(yàn)陰性但對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株進(jìn)行碳青霉烯酶基因檢測。2.選取52株包含25種ST型的CRKP,根據(jù)信噪比(S/N)、變異系數(shù)(CV系數(shù))以及不同分組的S/N比值確定特異峰挑選標(biāo)準(zhǔn),并篩選出一系列特異質(zhì)量峰,隨后利用這些特異峰對(duì)另外24株包含本實(shí)驗(yàn)室常見5種ST型的CRKP進(jìn)行分型,同時(shí)與多位點(diǎn)序列分型(MLST)結(jié)果進(jìn)行比較。3.首先選取118株肺炎克雷伯菌(ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌67株,非該型別的肺炎克雷伯菌51株)作為特異峰篩選組,對(duì)血平板上的純菌落進(jìn)行蛋白質(zhì)提取點(diǎn)樣后,利用MALDI-TOF MS獲得評(píng)分≥2.30的質(zhì)量圖譜,通過ClinPro Tools 3.0軟件和Flexanalysis 3.0軟件篩選出ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的最特異質(zhì)量峰。其次選取89株肺炎克雷伯菌(ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌37株,非該型別的肺炎克雷伯菌52株),同樣的試驗(yàn)方法獲取質(zhì)量圖譜,對(duì)該特異峰進(jìn)行驗(yàn)證。最后隨機(jī)收集95株麥康凱平板上生長的肺炎克雷伯菌且質(zhì)譜評(píng)分≥2.00的臨床分離株及其圖譜,進(jìn)一步評(píng)估此特異峰的臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果1.在64個(gè)模擬血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中,32株不產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株logRQ值平均為-0.85±0.14,32株產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株logRQ值平均為0.87±0.55,當(dāng)cutoff值設(shè)定為-0.45時(shí),根據(jù)logRQ值直接判斷腸桿菌科細(xì)菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶的敏感度和特異度均為100%。收集已檢出腸桿菌科細(xì)菌的臨床血培養(yǎng)陽性標(biāo)本共385例,其中81.3%(313/385)為碳青霉烯類抗菌藥物敏感的腸桿菌科細(xì)菌(CSE),logRQ值均小于-0.45,符合率為100%,另外18.7%(72/385)為碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌(CRE),其中62株的logRQ值大于-0.45,10株logRQ值小于-0.45,這些菌株中67株檢出碳青霉烯酶基因,另外5株未檢出常見的碳青霉烯酶基因。以碳青霉烯酶基因檢測為金標(biāo)準(zhǔn),利用MALDI-TOF MS厄他培南水解試驗(yàn)直接篩查碳青霉烯酶的特異度和敏感度分別為100%(5/5)和92.5%(62/67)。2.按照標(biāo)準(zhǔn)(1)S/N≥4(2)S/N比值≥1.5(3)CV≤40%,在52株CRKP中共篩選出45個(gè)特異峰,利用特異峰對(duì)其中的29株CRKP(只選取包含3個(gè)或3個(gè)以上菌株的ST型)進(jìn)行分型,與MLST分型結(jié)果符合率最高,達(dá)82.8%,按照此標(biāo)準(zhǔn)篩選出的特異峰對(duì)另外24株CRKP進(jìn)行分型,與MLST分型結(jié)果符合率達(dá)83.3%。3.在一定試驗(yàn)條件下,通過MALDI-TOF MS篩選獲得ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的最佳特異峰為m/z 4521,以該峰作為鑒別此型別細(xì)菌的特征峰,其特異度和敏感度分別為98.1%和97.3%,且該特異峰的重復(fù)性達(dá)97.4%。而采用臨床常規(guī)鑒定圖譜對(duì)特異峰的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估,其特異度和敏感度仍可達(dá)95.2%和96.9%。結(jié)論1.利用MALDI-TOF MS厄他培南水解試驗(yàn)可快速、準(zhǔn)確地篩查血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中腸桿菌科細(xì)菌的碳青霉烯酶,為臨床早期合理的抗感染治療提供重要依據(jù)。2.利用MALDI-TOF MS篩選出不同ST型CRKP的一系列特異峰,用于CRKP的分子流行病學(xué)分析,從而快速有效地監(jiān)測醫(yī)院感染的暴發(fā)流行。3.微生物實(shí)驗(yàn)室在臨床日常工作中可依據(jù)肺炎克雷伯菌鑒定圖譜是否存在特異峰m/z 4521來直接鑒別ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌,從而快速準(zhǔn)確地為臨床合理有效治療和院感控制提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5;O657.63
【圖文】：

圖 1：MALDI-TOF MS 檢測的厄他培南質(zhì)量峰和水解產(chǎn)物質(zhì)量峰Figure 1 Peaks of ertapenem and its hydrolysed, decarboxylated form detected by MALDI-TOFMS注：ETP 是對(duì)照，厄他培南可自行發(fā)生一定程度的水解；Positive 是 MALDI-TOF MS 厄他培南水解試驗(yàn)陽性結(jié)果；Negative 是 MALDI-TOF MS 厄他培南水解試驗(yàn)陰性結(jié)果3.1.3 logRQ 值及其 cutoff 值根據(jù)公式計(jì)算 32 株產(chǎn)酶株和 32 株不產(chǎn)酶株的 logRQ 值，繪制散點(diǎn)圖，見圖 2。與厄他培南溶液孵育 2 小時(shí)后，產(chǎn)酶株 logRQ 值的平均值為 0.87±0.55，不產(chǎn)酶株 logRQ 值的平均值為-0.85±0.14。繪制利用 logRQ 值判斷腸桿菌科細(xì)菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶的方法的 ROC 曲線，見圖 3，曲線下面積（area under curve，AUC）為 1.00，P 值<0.001，表明根據(jù) logRQ 值篩查腸桿菌科細(xì)菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶具有很高的敏感度和特異度。當(dāng)將cutoff值設(shè)定為-0.45時(shí)，尤登指數(shù)（Youden

圖 2：32 株 CRE 和 32 株 CSE 模擬血培養(yǎng)標(biāo)本水解試驗(yàn) logRQ 值分布Figure 2 LogRQ values of blood cultures simulated by 32 CRE and 32 CSE

圖 3 模擬血培養(yǎng)標(biāo)本 logRQ 值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果igure 3 Statistical analys is with the logRQ values of the blood culture simulat：A.利用 logRQ 值檢測菌株碳青霉烯酶的方法的受試者工作曲線（ROCB.不同 cutoff 值對(duì)應(yīng)的敏感度、特異度和尤登指數(shù)。14

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本文編號(hào)：2792956