發(fā)布時(shí)間：2020-07-25 19:24

【摘要】：背景立體定向消融放療對組織的損傷形式是高劑量小范圍的損傷,它對患者正常組織的損傷范圍小且治療次數(shù)少,現(xiàn)已廣泛用于肺癌早期的治療,但仍有約10%的患者會發(fā)生嚴(yán)重的放射性肺損傷,包括放射性肺炎和肺纖維化。GW5074是一種C-Raf的特異性抑制劑,它在小腦顆粒神經(jīng)元等細(xì)胞中均可通過抑制C-Raf的活性而發(fā)揮相應(yīng)的作用。但關(guān)于它與高劑量小范圍放射性肺損傷的研究至今未見報(bào)道,本課題旨在闡明GW5074在高劑量小范圍放射線誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其機(jī)制。目的本研究采用高劑量放射線照射后的小鼠肺泡上皮細(xì)胞MLE-12和高劑量小范圍放射線照射后的C3H/HeJCr小鼠作為研究對象,探討GW5074在高劑量小范圍放射線誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其機(jī)制,為放射性肺損傷的防治提供新的策略。方法將90Gy的高劑量放射線以3mm的直徑照射至C3H/HeJCr小鼠右肺,(1)通過蛋白芯片技術(shù)篩選出放射性肺損傷中變化最明顯的蛋白質(zhì);并進(jìn)一步經(jīng)Western blot和免疫組化驗(yàn)證。用8Gy的X射線照射MLE-12細(xì)胞后,(2)應(yīng)用Western blot分析在照射后各時(shí)間點(diǎn)C-Raf和p-C-Raf表達(dá)量的變化;(3)應(yīng)用Western blot分析GW5074對C-Raf磷酸化的作用;(4)通過顯微鏡觀察MLE-12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變;(5)應(yīng)用shRNA技術(shù)敲除該細(xì)胞中的Twist1基因,通過Western blot檢測sh-Twist1對Twist1表達(dá)量的抑制作用。(6)應(yīng)用Western Blot分析GW5074和sh-Twist1作用后p-C-Raf、Twist1、α-SMA和E-cadherin的表達(dá)情況。用75Gy的高劑量放射線以3mm的直徑照射C3H/HeJCr小鼠右肺,照射后6周將小鼠處死,制備肺組織石蠟切片,(7)應(yīng)用HE染色分析小鼠肺損傷的程度;(8)應(yīng)用免疫熒光雙染法分析α-SMA和E-cadherin的表達(dá)水平。結(jié)果1激活態(tài)的C-Raf蛋白在放射性肺損傷中的變化程度最顯著。為尋找HDSV放射性肺損傷中變化最大的功能蛋白,我們做了如下實(shí)驗(yàn):將HDSV放射線照射至小鼠右肺,經(jīng)過2周、4周以后,提取照射部位的肺組織蛋白,進(jìn)行了protein arrays實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的C-Raf蛋白在照射后2周較對照組增加了1.309倍,且在4周后增加到2.028倍,我們進(jìn)一步通過Western blot以及IHC結(jié)果證實(shí)了此結(jié)果的可靠性。2高劑量放射線照射后C-Raf、p-C-Raf在照射后各時(shí)間點(diǎn)的變化情況。高劑量放射線照射后MLE-12細(xì)胞中p-C-Raf的表達(dá)在照射后24h、48h、72h較對照組均有所增加(P0.05),并且在48h增加最為顯著(P0.05),而照射后6h、12h細(xì)胞中p-C-Raf以及照射后各時(shí)間點(diǎn)C-Raf的變化較對照組均無明顯變化(P0.05)。因此我們選用照射后48h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3通過Western blot驗(yàn)證GW5074對p-C-Raf的作用。GW5074組較對照組明顯抑制了C-Raf的激活(P0.05),而DMSO組和對照組p-C-Raf的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4通過顯微鏡觀察高劑量放射線作用后MLE-12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。未經(jīng)處理的MLE-12細(xì)胞顯示出鵝卵石上皮細(xì)胞形態(tài)并能清楚地觀察到細(xì)胞間的接觸,但經(jīng)放射線照射的細(xì)胞表現(xiàn)為紡錘體的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)且細(xì)胞間的接觸丟失。GW5074單獨(dú)處理不改變細(xì)胞的上皮樣結(jié)構(gòu),而在照射前用GW5074預(yù)處理有效地保護(hù)了上皮細(xì)胞免受照射引起的形態(tài)學(xué)變化。5應(yīng)用短發(fā)夾RNA(shRNA)技術(shù)敲除細(xì)胞中的Twist1基因,通過Western Blot檢測sh-Twist1對Twist1表達(dá)量的作用。sh-Twist1組較空載病毒(NC)組明顯抑制了Twist1的表達(dá)(P0.05),而NC組與對照組相比Twist1的表達(dá)無明顯差異(P0.05)。6通過Western Blot檢測GW5074和sh-Twist1作用后p-C-Raf、Twist1、α-SMA和E-cadherin的表達(dá)情況。高劑量放射線照射后可明顯激活C-Raf,并能使Twist1和α-SMA的表達(dá)量升高,E-cadherin的表達(dá)量降低。在照射前應(yīng)用GW5074處理細(xì)胞,p-C-Raf、Twist1和α-SMA的表達(dá)量明顯減少,而E-cadherin的表達(dá)量明顯增加(P0.05),而在照射前用sh-Twist1感染細(xì)胞,也能使Twist1和α-SMA的表達(dá)量明顯減少,E-cadherin的表達(dá)量明顯增加(P0.05),而p-C-Raf表達(dá)量的變化與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。7通過HE化學(xué)染色分析GW5074對HDSV放射線所造成小鼠肺損傷的作用。HE結(jié)果顯示在HDSV放射線照射前用GW5074預(yù)處理的小鼠肺損傷程度較單純照射組明顯減小(P0.05)。8通過免疫熒光染色分析肺組織中E-cadherin和α-SMA的表達(dá)水平。正常小鼠肺組織中E-cadherin以較高水平表達(dá),而α-SMA僅以極低水平表達(dá),在照射前用GW5074處理較單獨(dú)照射組明顯減少了α-SMA并增強(qiáng)了E-cadherin的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論1 激活態(tài)的C-Raf蛋白在放射性肺損傷中的變化程度最顯著;2 GW5074可能通過抑制C-Raf/Twist1通路來有效地抑制HDSV放射線誘導(dǎo)的小鼠肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R730.55
【圖文】：

結(jié)果3.1 激活態(tài)的 C-Raf 蛋白在放射性肺損傷中的變化程度最顯著。蛋白芯片結(jié)果提示磷酸化的 C-Raf 蛋白在 90Gy 放射線照射后 2 周較對照組增加了 1.309 倍，且在 4 周后增加到 2.028 倍（圖 1）。Western Blot 結(jié)果顯示接受 HDSV放射線照射的小鼠肺組織中 C-Raf 蛋白的磷酸化水平顯著增加（圖 2）。免疫組化結(jié)果證實(shí)了磷酸化的 C-Raf 蛋白從照射后第 7 天就開始顯著增加至 14 天時(shí)已布滿整個(gè)照射區(qū)域內(nèi)（圖 3）。

HDSV放射線照射后2周和4周肺組織Westernblot結(jié)果

25圖 3 HDSV 放射性肺損傷中 phospho-C-Raf 蛋白的免疫組化結(jié)果3.2 高劑量放射線照射后 C-Raf、p-C-Raf 與照射時(shí)間的關(guān)系。如圖 4，高劑量放射線照射后 MLE-12 細(xì)胞內(nèi)的 C-Raf 蛋白被激活(p-C-Raf)，在照射后 24h、48h、72h 較對照組均有所增加（P<0.05），而照射后 6h、12h 與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），并且在照射后 48h 較對照組的增加最為顯著（P<0.05），而 C-Raf 變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。因此我們采用照射后 48h 的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

【參考文獻(xiàn)】

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10 朱皓v

本文編號：2770258