【摘要】：目的:近年來白色念珠菌(Candida Albicans,CA)生物膜感染導(dǎo)致的耐藥性日趨嚴(yán)重,研究表明生物膜的形成是該菌感染性、耐藥性不斷增強(qiáng)的重要因素。目前臨床多是采用大劑量的抗真菌藥物治療此類感染,從而進(jìn)一步增加了耐藥性。而中藥由于其抗菌譜廣、抗菌作用明顯以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),已成為目前抗感染治療的重要研究內(nèi)容。故本研究擬選擇中藥黃連的主要活性成分鹽酸小檗堿作為干預(yù)手段,通過分析該活性成分對(duì)白色念珠菌生物膜形成表型和關(guān)鍵基因表達(dá)的影響,初步探討鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌生物膜的抑制作用及其分子機(jī)制,為臨床選擇鹽酸小檗堿輔助用于白色念珠菌生物膜感染的預(yù)防和治療提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.通過微量稀釋法測定鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生長的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC);通過構(gòu)建白色念珠菌體外生物膜模型,并采用XTT法作生物膜生長動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)、hochest染色法觀察菌絲形成動(dòng)態(tài)過程,明確本實(shí)驗(yàn)室條件下生物膜構(gòu)建條件以及芽管/菌絲形成時(shí)間。2.通過XTT法和激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)技術(shù)檢測高、中、低濃度(4MIC、MIC、1/4MIC)鹽酸小檗堿干預(yù)下白色念珠菌生物膜膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性、生物膜微觀形態(tài)和厚度的變化,研究鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。3.通過hochest染色法檢測高、中、低濃度(4MIC、MIC、1/4MIC)鹽酸小檗堿干預(yù)下白色念珠菌菌絲形成的變化,研究藥物對(duì)白色念珠菌菌絲形成的抑制作用,并進(jìn)一步驗(yàn)證菌絲相與生物膜形成之間的關(guān)系。4.采用RT-PCR技術(shù)檢測高、中、低濃度(4MIC、MIC、1/4MIC)鹽酸小檗堿對(duì)菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)表達(dá)的影響,研究基因、藥物、菌絲以及生物膜形成之間的關(guān)系,探尋鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生物膜形成的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果:1.鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231和臨床菌株CA2119浮游菌具有明顯的抑制作用,其MIC均為32μg/mL;成功構(gòu)建體外生物膜模型,且確定了早期、中期和成熟期生物膜形成時(shí)間,分別為0-6h,6-24h和24-48h,芽管/菌絲形成時(shí)間在4-6h。2.對(duì)于ATCC10231和CA2119早期(4h、6h)生物膜:與對(duì)照組相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿可以明顯抑制生物膜膜內(nèi)細(xì)胞活性、破壞其微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)以及降低生物膜厚度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但8μg/mL鹽酸小檗堿僅對(duì)ATCC10231有明顯的抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),對(duì)CA2119無明顯抑制作用;與4μg/mL氟康唑相比,128μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用明顯優(yōu)于氟康唑,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但32μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用不及氟康唑;并且與ATCC10231相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)CA2119生物膜內(nèi)細(xì)胞活性以及生物膜厚度的抑制率較ATCC10231低,表明鹽酸小檗堿對(duì)ATCC10231的抑制效果優(yōu)于CA2119;同時(shí)鹽酸小檗堿對(duì)ATCC10231的6h早期生物膜較4h早期生物膜抑制效果更為顯著,提示6h早期生物膜可能是鹽酸小檗堿抑制細(xì)胞活性的適宜時(shí)間。3.對(duì)于ATCC10231和CA2119的酵母相細(xì)胞:與對(duì)照組相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿均能明顯抑制白色念珠菌從酵母相到菌絲相的轉(zhuǎn)化,其菌量減少,菌絲形成受阻,而8μg/mL鹽酸小檗堿無明顯抑制作用。4.對(duì)于ATCC10231早期生物膜:與對(duì)照組相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿均能明顯抑制4h和6h早期生物膜菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而8μg/mL鹽酸小檗堿則無明顯抑制作用。與4μg/mL氟康唑相比,128μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)4h生物膜的抑制作用明顯優(yōu)于氟康唑,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)于CA2119早期生物膜:與對(duì)照組比,128μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制6h早期生物膜菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),32μg/mL和8μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制HWP1和ECE1的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但對(duì)4h早期生物膜,128μg/mL鹽酸小檗堿無明顯抑制作用,32μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制Efg1和ALS1的表達(dá),而8μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制HWP1和ECE1的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.高濃度與中濃度鹽酸小檗堿可以通過殺滅生物膜膜內(nèi)細(xì)胞、破壞生物膜完整結(jié)構(gòu)從而抑制白色念珠菌生物膜的形成,其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達(dá),阻延白色念珠菌發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化,影響生物膜形成關(guān)鍵物質(zhì)-菌絲的形成實(shí)現(xiàn)的。2.鹽酸小檗堿對(duì)臨床菌株表型以及關(guān)鍵基因的表達(dá)具有一定的抑制效果,但抑制效果不及標(biāo)準(zhǔn)菌株,提示鹽酸小檗堿對(duì)臨床菌株的干預(yù)作用還存在許多問題,需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究探討,耐藥性的產(chǎn)生可能會(huì)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其他抗真菌藥物的抵抗性。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5
【圖文】：

圖 2-1 ATCC10231 生物膜細(xì)胞生長曲線 白色念珠菌芽管/菌絲形成動(dòng)態(tài)過程實(shí)驗(yàn)用 hochest 染色法對(duì)培養(yǎng) 0-8h 的白色念珠菌進(jìn)行染色，從而觀察形成過程，結(jié)果見圖 2-2。白色念珠菌在培養(yǎng) 2h 左右形成大量芽生孢

ATCC10231菌絲形成過程（熒光倒置顯微鏡，400倍×）

圖 2-1 鹽酸小檗堿對(duì)不同階段鹽酸小檗堿膜內(nèi)細(xì)胞活性的抑制率A 表示與 ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，a 表示與 ATCC10231 6h 生物膜相比，p<0.05與 ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，b 表示與 ATCC102316h 生物膜相比，p<0.05，C 表示ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，c 表示與 ATCC102316h 生物膜相比，p<0.05.2 各藥物干預(yù)組中白色念珠菌生物膜微觀形態(tài)和厚度的變化

【參考文獻(xiàn)】

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1 游雪嬌;李良秋;馬連營;彭斐元;;激光共聚焦掃描顯微鏡在抗菌機(jī)理研究中的應(yīng)用[J];微生物學(xué)通報(bào);2015年06期

2 萬江帆;唐春萍;沈志濱;江濤;;中藥單體聯(lián)用抗真菌藥物抗耐藥白色念珠菌的研究現(xiàn)狀[J];中國中藥雜志;2014年01期

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4 楊夢琪;楊帆;;白色念珠菌生物膜的形成及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2012年05期

5 鄭玉榮;劉濤峰;張虹亞;;中藥成分抗白念珠菌的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志;2011年06期

6 陽雋;張?zhí)焱?朱家馨;;卡泊芬凈對(duì)生物膜態(tài)白色念珠菌體外抑菌作用的試驗(yàn)研究[J];中國藥房;2011年33期

7 張莉;張永信;;抗真菌藥物的開發(fā)歷程與研究進(jìn)展[J];上海醫(yī)藥;2011年07期

8 郜向娜;余加林;蘆起;劉立婷;;四唑鹽減低法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡定量分析表皮葡萄球菌生物被膜體外模型[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2010年12期

9 王丹敏;靳穎;董小青;劉麗英;;白色念珠菌生物膜生長動(dòng)力學(xué)分析和形態(tài)學(xué)觀察[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2010年09期

10 王聰;白麗;;真菌生物膜研究進(jìn)展[J];中國病原生物學(xué)雜志;2010年03期

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1 許懿;小檗堿與氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌的作用機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 陳建宏;中藥香蓮?fù)庀匆簩?duì)不同念珠菌株耐藥性基因組學(xué)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2009年

3 權(quán)華;小檗堿與氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌的作用及作用機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

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3 王彩瑞;4種中藥提取物體外抗白色念珠菌的敏感性研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2762900