【摘要】：目的:探討外周血炎癥因子及肺組織MHCⅡ基因在脂多糖(LPS)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)模型小鼠體內(nèi)的表達(dá)量改變,通過(guò)研究炎癥反應(yīng)通路探討慢病毒轉(zhuǎn)染沉默肺組織MHCⅡ基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞移植(EPCs)治療ARDS的作用,為治療ARDS提供新思路。方法:選78只昆明白雄性小鼠,隨機(jī)分為4組,(1)正常對(duì)照組(NC組)(2)膿毒癥模型組(LPS組)(3)內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組(LPS+EPCs組)(4)MHCⅡ慢病毒干擾組(LPS+MHCⅡ-+EPCs組)。ARDS模型建立:以12mg/kg向(2)(3)(4)組小鼠尾靜脈注射LPS,建立膿毒模型;1小時(shí)后向(3)組小鼠尾靜脈注射200ul EPCs;向(4)組小鼠尾靜脈注射MHCⅡ慢病毒100ul,觀察1小時(shí)后,再向(4)組小鼠尾靜脈注射200ul EPCs。模型建立第三天(d3),(3)與(4)組,用10%苯巴比妥淺麻醉后活體成像儀上熒光示蹤;d3及d7各組小鼠麻醉解剖,留取肺組織行HE染色及快速冰凍切片,觀察各組顯微鏡下病理改變及熒光定位情況;外周血酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(Elisa)方法檢測(cè)炎性因子TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a的表達(dá)量;熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)TLR-4以及MHCⅡ mRNA表達(dá)情況;蛋白免疫印跡法(Western blot)方法檢測(cè)MHCⅡ蛋白的表達(dá)情況。多組間數(shù)據(jù)分析采用方差分析,Pearson法分析相關(guān)性。結(jié)果:1、組織病理結(jié)果:NC組肺組織結(jié)構(gòu)正常,LPS組肺泡及間質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂無(wú)序,炎性浸潤(rùn)及纖維素樣滲出,肺泡及毛細(xì)血管腔出血狹窄,呈現(xiàn)大面積水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)損傷;LPS+EPCs組較LPS組損傷減輕;LPS+MHCⅡ-+EPCs組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,肺泡及間質(zhì)結(jié)構(gòu)基本完整。2、EPCs及MHCⅡ慢病毒示蹤結(jié)果:LPS+EPCs組與LPS+MHCⅡ-+EPCs組組肺組織快速冰凍切片均可見(jiàn)標(biāo)記EPCs及MHCⅡ慢病毒的綠色熒光表達(dá),活體顯像也可見(jiàn)標(biāo)記EPCs及MHCⅡ慢病毒的熒光主要在胸部表達(dá)。3、Elisa法檢測(cè)炎性因子TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a表達(dá),在NC組、LPS組、LPS+EPCs組、LPS+MHCⅡ-+EPCs組表達(dá)量d3分別為(1.56±0.111、38.0±11.0、0.244±0.0794、24.9±4.05)pg/m L,(2.98±0.187、273±27.6、5.36±0.658、107±18.1)pg/m L,(2.54±0.182、125±27.3、2.23±0.763、71.4±8.13)pg/m L,(1.81±0.201、59.0±15.6、0.531±0.150、44.1±4.81)pg/m L。d7分別為(1.54±0.129、2.90±0.194、2.33±0.159、1.63±0.166)pg/m L,(36.7±11.7、233±28.9、111±42.0、44.1±13.9)pg/m L,(0.292±0.0510、2.94±0.696、1.57±0.439、0.356±0.0783)pg/m L,(24.0±4.33、85.0±15.6、63.6±11.6、32.7±5.23)pg/m L。LPS組較NC組均表現(xiàn)升高(均P0.0001),而LPS+EPCs組及LPS+MHCⅡ-+EPCs組較LPS組均表現(xiàn)降低(均P0.0001),且LPS+MHCⅡ-+EPCs組較LPS+EPCs組又表現(xiàn)明顯降低(均P0.0001),LPS+MHCⅡ-+EPCs組較NC組無(wú)明顯差異(P0.05)。d3與d7無(wú)明顯差異(P0.05)。4、RT-PCR檢測(cè)TLR-4、MHCⅡ mRNA表達(dá),在NC組、LPS組、LPS+EPCs組、LPS+MHCⅡ-+EPCs組d3分別(89.1±55.6、0.303±0.0821),(2222±924、5.62±0.819),(743±351、2.98±0.773),(174±91.2、0.526±0.0745)。d7分別為(93.9±62.3、0.286±0.0639),(1533±688、4.55±0.697),(592±144、2.88±0.682),(156±85.5、0.464±0.109)。LPS組較NC組表達(dá)量均表現(xiàn)升高(均P0.0001),而LPS+EPCs組及LPS+MHCⅡ-+EPCs組較LPS組表達(dá)量均表現(xiàn)降低(均P0.0001),且LPS+MHCⅡ-+EPCs組較LPS+EPCs組表達(dá)量又明顯降低(均P0.0001),LPS+MHCⅡ-+EPCs組較NC組無(wú)明顯差異(P0.05)。5、western blot檢測(cè)MHCⅡ蛋白表達(dá),NC組、LPS組、LPS+EPCs組、LPS+MHCⅡ-+EPCs組,d3分別為(0.356±0.0669),(1.49±0.310),(0.924±0.200),(0.544±0.0558)LPS組較NC組MHCⅡ蛋白灰度值均升高(均P0.0001),而LPS+EPCs組及LPS+MHCⅡ-+EPCs組較LPS組MHCⅡ蛋白灰度值均表現(xiàn)降低(均P0.0001),且LPS+MHCⅡ-+EPCs組較LPS+EPCs組MHCⅡ蛋白灰度值又表現(xiàn)明顯降低(均P0.0001),LPS+MHCⅡ-+EPCs組較NC組無(wú)明顯差異(P0.05)。6、d3實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠰PS組MHCⅡ與TLR4、NF-κB、TNF-a、IL-12均呈正相關(guān)(r2=0.824、0.867、0.763、0.830,且均p0.05),同時(shí)TLR4在基因及蛋白水平呈強(qiáng)正相關(guān)(r2=0.991,且均p0.001);LPS+EPCs組MHCⅡ基因相對(duì)表達(dá)量與IL-12、MHCⅡ蛋白、TLR4 mRNA及其蛋白、NF-κB均呈正相關(guān)(r2=0.824、0.880、0.978、0.978、0.938,且均p0.05),同時(shí)TLR4在基因及蛋白水平呈強(qiáng)正相關(guān)(r2=0.998,且p0.001);LPS+MHCⅡ-+EPCs組MHCⅡ基因相對(duì)表達(dá)量與IL-12、MHCⅡ蛋白、NF-κB、TNF-a、TLR4蛋白均呈正相關(guān)(r2=0.965、0.926、0.846、0.795、0.875,且均p0.05),同時(shí)TLR4在基因及蛋白水平呈強(qiáng)正相關(guān)(r2=0.998,且p0.001)。結(jié)論:1、膿毒所致ARDS時(shí)炎癥因子TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a明顯增高;肺組織MHCⅡ基因及蛋白表達(dá)明顯增高,TLR-4基因及蛋白表達(dá)明顯增高;MHCⅡ與TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a明顯正相關(guān)。2、EPCs移植可以部分減少TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a及MHCⅡ的表達(dá);MHCⅡ與TLR-4、NF-KB、IL-12明顯正相關(guān)。3、MHCⅡ基因干擾后進(jìn)行EPCs移植,可以明顯抑制TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a及MHCⅡ的表達(dá);且均較單獨(dú)EPCs移植組明顯下降;MHCⅡ與TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a依然表現(xiàn)為正相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R459.7
【圖文】：

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文（2019） 212.1 sepsis 模型鑒定向 30g 雄性小鼠體內(nèi)尾靜脈注射 LPS，經(jīng)過(guò)前期造模摸索條件后以 12mg/kg注射效果最佳，光學(xué)顯微鏡鏡下病理切片改變可見(jiàn) d3 及 d7 與正常組對(duì)比顯示肺泡上皮以及毛細(xì)血管上皮周圍浸潤(rùn)大量中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞，并有炎性滲出、充血水腫、透明膜形成，肺泡腔內(nèi)狹窄及“氣球樣”改變，肺間質(zhì)正常結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)彌漫性的肺泡損傷改變，d3 損傷評(píng)分為 10 分，d7 損傷評(píng)分 20分。

圖 2 4 種病毒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞結(jié)果注：如圖 2 所示，從左到右分別為 LV3-Ciita-Mus-408、LV3-Ciita-Mus-1057、LV3-Ciita-Mus-2001 、LV3-NC、空白對(duì)照。將 4 種病毒侵染后的巨噬細(xì)胞提取 RNA，進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，由表 5、圖 3可見(jiàn) LV3-Ciita-Mus-408 沉默效果最好，故選擇其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾病毒。表 5 4 種病毒在小鼠巨噬細(xì)胞 mRNA 表達(dá)情況LV3-NC LV3-Ciita-Mus-408LV3-Ciita-Mus-2001LV3-Ciita-Mus-1057mRNA 相對(duì)表達(dá)量1 0.401±0.026 0.757±0.207 0.653±0.184F 值 7.285P 值 0.025

圖 3 4 種病毒在小鼠巨噬細(xì)胞 mRNA 表達(dá)情HE 染色結(jié)果組模型建立 d3，鏡下可見(jiàn) LPS 組較 NC 組肺泡及纖維素樣滲出，肺泡及毛細(xì)血管腔出血狹窄， LPS 組損傷減輕、較 NC 組損傷減輕更明顯，但PCs 組較 LPS 組炎性浸潤(rùn)減輕、較 LPS+EPCs 組-+EPCs 組較 NC 組無(wú)明顯差異。模型建立 d7，鏡間質(zhì)水腫、充血明顯，LPS+EPCs 較 LPS 組損顯，但依舊沒(méi)有恢復(fù)正常。LPS+MHCII-+EPCsPS+EPCs 組又進(jìn)一步減輕，且 LPS+MHCII-+Ed3 與 d7 各組進(jìn)行比較，NC 組、LPS 組、LP 組各組均無(wú)明顯差異。

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本文編號(hào)：2755832