【摘要】：目的:探究重組PD-L1對T細胞功能的影響及其在小鼠a GVHD的作用及機制。方法:1.體外分選得到CD4~+T細胞和CD4~+CD25-細胞,將其在單一Anti-CD3、Anti-CD3~+Anti-CD28和MLR三種模式下進行培養(yǎng),通過CD69、CD44、CTLA-4、Lag-3、Tim-3檢測細胞活化,CFSE和Annexin V-FITC/PI進行細胞增殖及凋亡檢測,行ELISA及胞內細胞因子染色檢測細胞因子表達,流式細胞術檢測PD-L1對Treg細胞分化的影響。探究可溶性PD-L1蛋白在不同條件下對T細胞活性、增殖、凋亡及細胞因子分泌的影響,以及其與Treg細胞之間的聯(lián)系。2.采用PAS方法構建PD-L1質粒,以PCDN3.1為載體連接小鼠PD-L1基因片段。體內構建三種a GVHD模型,移植前1天,對照組受體鼠通過尾靜脈注射PCDN3.1質粒,實驗組注射PD-L1質粒。(1)BALB/c(H2Kd)作為受體鼠接受650c Gy全身性致死性輻照,4小時后通過尾靜脈注射的方法輸注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓細胞和5×106全脾細胞;(2)C57BL/6(H2Kb)作為受體鼠接受800c Gy全身性致死性輻照,4小時后通過尾靜脈注射的方法輸注1×107 BALB/c(H2Kd)骨髓細胞和1×107全脾細胞;(3)BALB/c(H2Kd)作為受體鼠接受650c Gy全身性致死性輻照,4小時后通過尾靜脈注射的方法輸注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓細胞和5×106去除Treg細胞的全脾細胞;觀察三種模型下小鼠生存和體重變化,記錄a GVHD評分。移植后第7天或第14天采用流式細胞術檢測前兩種模型中兩組小鼠的脾臟中T細胞各亞型的變化及細胞因子的表達量。結果:1.體外Anti-CD3刺激的情況下,PD-L1抑制CD4~+T細胞的增殖、活性及細胞因子的表達,同時促進其凋亡;但是對Treg的增值和分化沒有影響。在Anti-CD3和Anti-CD28培養(yǎng)情況下,PD-L1抑制CD4~+T細胞的增殖、活性及細胞因子的表達,促進凋亡,同時可以誘導Treg細胞的產生;2.PD-L1在IL-2及TGF-β作用下抑制Treg細胞的分化和增殖;3.過表達PD-L1可以顯著減輕a GVHD癥狀,延長小鼠生存;4.PD-L1能夠減弱移植后a GVHD小鼠靶器官的病理損傷;5.在混合淋巴細胞反應中,PD-L1抑制T細胞的增殖但不影響Treg細胞的分化和增殖;6.PD-L1抑制小鼠a GVHD是Treg細胞非依賴的,不同模型下PD-L1仍能發(fā)揮抑制a GVHD的作用;7.不同模型下,PD-L1仍能發(fā)揮抑制a GVHD的作用。結論:1.PD-L1可以直接抑制T細胞的活性、增殖及細胞因子的分泌;2.PD-L1主要通過抑制效應T細胞的表達及功能減輕小鼠a GVHD癥狀;3.PD-L1抑制小鼠a GVHD是通過Treg細胞非依賴的途徑。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R457.7;R733
【圖文】：

15圖 1.在 Anti-CD3 體外培養(yǎng)下，加入可溶性 PD-L1 蛋白會抑制 CD4+T 細胞的、活化、細胞因子的分泌，同時促進其凋亡。A-D.兩種細胞在實驗組和對照組胞增殖及 Treg 比例的變化。E-F.加入 PD-L1 后對細胞凋亡的影響。G.胞內染色實驗組細胞內細胞因子表達水平。H.體外培養(yǎng) 3 天后，流式檢測細胞表面負性免控因子的表達。I-J.ELISA 檢測體外細胞培養(yǎng)上清，比較兩組之間的差別。*，P<0，0.001<P<0.01，***，P<0.001。

圖 2.在 Anti-CD3 聯(lián)合 Anti-CD28 體外培養(yǎng)下，加入可溶性 PD-L1 蛋白會抑4+T 細胞的增殖、活化、細胞因子的分泌，促進其凋亡，同時誘導 Treg 的產B.兩種細胞在實驗組和對照組中，細胞增殖及 Treg 比例的變化。C-D.加入 PD對細胞凋亡的影響。E.胞內染色觀察比較細胞內細胞因子表達水平。F.體外培后，流式檢測細胞表面負性免疫調控因子的表達。G-H.ELISA 檢測體外細胞培，比較兩組之間的差別。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。3. PD-L1 在 IL-2 及 TGF-β作用下抑制 Treg 細胞的增殖前面的研究提示 PD-L1 可能誘導 iTreg 細胞的分化和增值，為了進一步研-L1 對 Treg 細胞的影響，我們建立了體外 Treg 誘導體系，在行 Anti-CDti-CD28 包被的板子中加入低濃度的 IL-2 (50IU/ml) 和 TGF-β（2.5ng/ml），誘導 胞的產生。我們發(fā)現(xiàn)在體外誘導培養(yǎng)體系中，無論初始誘導的 CD4+T 細胞中是

圖3.體外誘導 Treg 細胞產生的體系中，可溶性 PD-L1 通過抑制 Treg 細胞的增降低 Treg 細胞的表達。A.在誘導體系中，PD-L1 對 Total CD4 細胞增殖及 Treg 細的影響。B.在誘導體系中，PD-L1 對 CD4+CD25-細胞增殖及 Treg 細胞的影響。C.PD對 Treg 細胞增殖的影響。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。4.4. PD-L1 質粒構建及在小鼠體內的表達通過體外實驗我們發(fā)現(xiàn) PD-L1 在不同體系下均能抑制 T 細胞的活化、增殖及胞因子的分泌。因此，我們進一步通過體內 aGVHD 模型研究 PD-L1 對異基因反細胞的影響，及其在 aGVHD 發(fā)生發(fā)展中的作用。我們采用高壓水流動力學方法注PD-L1 過表達的質粒，從而在體內過表達 PD-L1。將目的基因 PD-L1 與 PCDN3.粒重組后在 TOP10 菌株中表達，我們將產物進行酶切鑒定發(fā)現(xiàn)目的基因片段在 75左右與 PD-L1 基因一致（圖 A）。為了了解尾靜脈注射 PD-L1 質粒能否在小鼠體內

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本文編號：2750041