【摘要】：隨著人們健康觀念的提升,疾病診斷的靈敏性與時效性變得愈發(fā)重要。即時診斷技術Point of care(POCT),指在不受時間、地點限制的條件下,實現(xiàn)醫(yī)學樣本的快速檢測分析。微流控芯片是現(xiàn)代醫(yī)學檢測的重要工具,利用集成于芯片上的微反應器和微檢測設備,僅需少量的液體,即可完成相對快速準確的實驗分析。其中,紙基微流控芯片加工簡便、成本低廉,可與酶催化顯色反應結合,通過可視化信號實現(xiàn)快速診斷,從而擺脫對專業(yè)儀器的依賴。但是紙芯片的功能相對單一,研究者希望利用多樣化的材料對紙芯片進行修飾,克服這一限制。酶和探針蛋白的有效固定直接影響紙基生物芯片的性能。而納米材料以其獨特形貌、催化性能及生物相容性,為提高生物分子的有效固定,構建高特異性和高靈敏度的生物芯片提供了新的方向。本文創(chuàng)新性地在紙纖維上原位生長蛋白-無機材料雜化物,固定蛋白探針,實現(xiàn)對免疫球蛋白SIgA的檢測。進一步挖掘無機納米材料的催化性能,將人造酶和天然酶直接組裝到纖維上,實現(xiàn)對葡萄糖的快速、靈敏、低成本的檢測。此外,為了使紙芯片的使用更加簡便、高效,又研發(fā)了移液器槍頭與紙芯片結合的裝置用于生物化學檢測。本論文的主要研究內容如下:1.紙基原位生長protein G-無機雜化材料檢測分泌型免疫球蛋白A(SIgA)分泌型SIgA(SSIgA)是機體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分。呼吸道分泌液中SSIgA含量的升高,提示病原體的侵襲。本部分工作結合protein G能特異性與抗體分子的Fc段結合的生物學特性,設計了protein G-無機雜化材料,實現(xiàn)抗體在紙基芯片的定向固定,提高基于紙基的SSIgA免疫檢測的靈敏度。本研究通過對不同類型的紙類基底材料的非特異性吸附對比,選擇聚酯纖維作為基底材料。隨后將無機溶液(MnSO_4)和蛋白溶液(protein G)依次滴加到紙類基底材料,原位合成有機-無機雜化材料。優(yōu)化protein G的濃度與用量,實現(xiàn)快速在紙基纖維上原位生長protein G-無機雜化材料。通過與試管中液相合成蛋白-無機雜化材料的方法進行比較,發(fā)現(xiàn)直接滴加反應液到紙基纖維網絡原位生長雜化材料可以顯著提高生物分子的利用效率,避免生物分子的浪費;此外,通過移液管對液體的精準操作,為后續(xù)免疫反應提高了穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。protein G與抗體Fc段結合,使抗體結合的關鍵部位Fab功能區(qū)面向待檢物加入的方向。并紙為固相基底,進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),檢測樣品中SSIgA的含量�？梢暬Y果顯示,肉眼可見的最低SSIgA濃度為1 ng/mL,達到了基于酶標儀分析的ELISA試劑盒的檢測線�；诘统杀炯埢拿庖叻治龅靡嬗谠簧Lprotein G無機雜化材料,其有效固定的protein G通過抗體的定向固定,為免疫反應提供了可進行抗原識別的抗體功能區(qū)(Fab片段)。更為重要的是,基于紙基的靈敏蛋白分析,擺脫了對專用設備的依賴,為POCT應用打下基礎。2.基于紙基原位生長酶-Mn_3(PO_4)_2雜化材料用于可視化檢測葡萄糖錳是一種變價金屬,研究發(fā)現(xiàn)以錳為基礎的納米材料,可被賦予獨特的催化活性。在蛋白-無機雜化材料中,Mn_3(PO_4)_2的功能值得深入挖掘。為了進一步探索雜化材料中無機部分的催化活性,用牛血清蛋白(BSA)合成BSA-Mn_3(PO_4)_2,通過優(yōu)化磷酸根的濃度,獲得具有過氧化物酶活性的BSA-Mn_3(PO_4)_2,展示了蛋白-無機物雜化材料除了蛋白固定的功能外的另一獨特性能。以此為基礎,在紙基上原位合成了葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOx)-Mn_3(PO_4)_2(GOx-Mn_3(PO_4)_2),通過在Whatman?濾紙上依次滴加0.1M硫酸錳和含有酶的磷酸二氫鉀生成GOx-Mn_3(PO_4)_2雜化材料用于檢測葡萄糖。通過優(yōu)化酶的濃度和過氧化物酶的底物(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)用量,構建了基于酶-Mn_3(PO_4)_2雜化材料的葡萄糖紙基芯片�？疾炝思埢酒撵`敏度、穩(wěn)定性、分析重復性和特異性等性能,結果顯示原位生長酶-Mn_3(PO_4)_2的紙基芯片檢測葡萄糖時肉眼可見的最低檢出限為0.1 mM,不僅能特異性的檢測葡萄糖而且分析重復率為95%-105%。其靈敏的檢測得益于原位生長酶-Mn_3(PO_4)_2雜化物:生物酶(GOx)在氧化生物分子(葡萄糖)的過程中生成過氧化氫(H_2O_2)。后者即刻被雜化物中的Mn_3(PO_4)_2催化還原,并氧化TMB底物。由于酶-Mn_3(PO_4)_2雜化物中,生物酶和擬酶結合緊密,減少了反應中間產物擴散的距離,提高了反應效率。為了展示其在真實病理樣品中的運用,對真實病理血清樣品中的葡萄糖進行監(jiān)測,并與商品化的試紙條和葡萄糖儀的檢測結果進行對比。結果展示了原位生長酶無機雜化材料的紙芯片具有真實情況下運用的潛力。3.結合紙基微流控芯片和移液槍頭設計的快速檢測裝置即時診斷中會涉及到病原物或感染性樣品的檢測,為了避免具有潛在危害的生物污染,檢測分析盡量在封閉的條件下進行。而普通紙基多為開放式,使用時具有一定的風險。針對這一問題,本研究將紙基微流控芯片與標準的移液槍頭結合,建立一個快速、安全和無污染的檢測裝置。利用移液槍的吸液過程完成進液,三棱柱型的紙芯片放入到移液槍頭的合適位置,實現(xiàn)3種樣品同時且互不干擾的檢測。移液槍頭的吸液過程準確的將待測樣品轉移到紙帶上,通過可視化的信號得到檢測結果。通過同時檢測人工尿液中葡萄糖,蛋白質和pH測定了這種裝置多樣品檢測的能力。因此該器件制作簡單,使用方便,可以用于生物和化學實驗。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O657;R44
【圖文】：

第 1 章 緒論紙基微流控芯片微流控芯片基微流控芯片的原則是通過前處理將紙纖維分為親水的疏水線之間的區(qū)域作為流動通道，流體由于毛細穿過疏水線，即形成了微流體通道。我們常用的制作有：石蠟打印[44; 45]、噴墨打印[46]、繪圖法、切割法、激網印刷[49]等。光刻法指利用傳統(tǒng)的光刻法完成光刻種各樣的圖案。繪圖法指的是利用繪圖儀在濾紙上形電腦控制的 X-Y Knife Plotter 切割紙或者硝酸纖維膜.1[43]，利用切割法制作了形狀各異的 2D 紙芯片。

圖 1.2 3D 紙基微流控芯片[52; 53]。(I)3D 紙基微流控芯片的圖示。(II)紙基芯片的展開圖示1.2.2 紙基微流控芯片在生物分析中的運用紙基微流控芯片可將多個分析檢測部分集成于一張紙芯片上。紙芯片具有制作簡單、成本低廉和分析時間短等優(yōu)點，使其廣泛的運用于生物分析領域。到目前為此，臨床上尿液、淚液以及血液中多種分析物的檢測在紙基微流控芯片上成功運用。最常見的包括葡萄糖[31; 54; 55]、蛋白質[55]、尿酸[56]、乳酸[57]、膽固醇[58]以及免疫分子[59]等。1.2.3 紙基微流控芯片幾種常用的檢測手段紙基芯片常用的檢測手段主要有比色檢測法、電化學檢測法、熒光法、電化學發(fā)光法和基于納米顆粒的檢測方法等。其中，比色檢測法、電化學檢測法和基于納米顆粒的方法在紙基微流控芯片中最為常用。

圖 1.2 3D 紙基微流控芯片[52; 53]。(I)3D 紙基微流控芯片的圖示。(II)紙基芯片的展開圖示1.2.2 紙基微流控芯片在生物分析中的運用紙基微流控芯片可將多個分析檢測部分集成于一張紙芯片上。紙芯片具有制作簡單、成本低廉和分析時間短等優(yōu)點，使其廣泛的運用于生物分析領域。到目前為此，臨床上尿液、淚液以及血液中多種分析物的檢測在紙基微流控芯片上成功運用。最常見的包括葡萄糖[31; 54; 55]、蛋白質[55]、尿酸[56]、乳酸[57]、膽固醇[58]以及免疫分子[59]等。1.2.3 紙基微流控芯片幾種常用的檢測手段紙基芯片常用的檢測手段主要有比色檢測法、電化學檢測法、熒光法、電化學發(fā)光法和基于納米顆粒的檢測方法等。其中，比色檢測法、電化學檢測法和基于納米顆粒的方法在紙基微流控芯片中最為常用。

【參考文獻】

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本文編號：2748331