【摘要】：放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療較為常見的并發(fā)癥之一,不僅限制了放療方案的制定和腫瘤的局部控制率,同時對患者生存質量以及存活率也產生了嚴重的影響。目前對于放射性肺損傷(Raiation-induced lung injury,RILI)尚缺乏有效的治療方法。間充質干細胞(MSCs)可以歸巢至受損組織,因此被廣泛用作基因治療的載體。此外,MSCs還可以通過分化為上皮細胞,分泌多種生物活性物質等來修復受損的組織。課題組之前的研究證實,MSCs可以歸巢至放射損傷的肺臟,并抑制放射誘導的上皮細胞凋亡。多項研究已經表明,基因修飾可以增強間充質干細胞(MSC)的功能,已經成為治療多種肺部疾病的有力工具。核心蛋白多糖(Decorin)是細胞外基質(ECM)中普遍存在的成分,可以與膠原蛋白結合,阻止膠原纖維的形成并破壞其組織。本研究擬探討Decorin基因修飾的MSCs對放射性肺損傷的治療作用及其作用機制。首先,我們制備攜帶Decorin基因的復制缺陷型腺病毒Ad-DCN,獲得高表達Decorin的MSC,即MSCs.DCN,并分析了DCN高表達對MSCs細胞生物學特性的影響。分離得到的臍帶MSCs(UC-MSCs)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),擴增至2-4代。用150MOI Ad-DCN或Ad-Null感染UC-MSCs,感染后48h,通過流式細胞術分析其免疫表型;用APC結合的Annexin-V和PI標記細胞,并通過流式細胞術分析細胞凋亡;用染料dye670標記MSC,第二天用Ad-DCN或Ad-Null感染細胞,然后在感染后的不同時間,通過流式細胞術測量熒光強度并計算增殖率;MSCs感染腺病毒Ad-DCN或Ad-Null后24h和48h,提取總RNA,采用實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Decorin基因及其靶基因表達情況。實驗結果提示:制備的Ad.DCN符合下一步實驗要求;高表達Decorin基因對MSCs細胞的表型和凋亡沒有明顯影響,對MSC細胞的增殖也沒有明顯影響,只是在感染后72h檢測到輕微的增殖抑制。其次,我們建立了放射性肺損傷的動物模型并制定了治療方案。將86只C57BL/c小鼠進行胸部局部Co60γ射線照射,劑量為20Gy。另外20只未照射小鼠作為正常對照組。將模型小鼠隨機分為5組:即照射組(照射后6h尾靜脈注射PBS,20只),MSCs.DCN PR 6h組(照射后6h尾靜脈注射MSCs.DCN,20只),MSCs.Null PR 6h組(照射后6h尾靜脈注射MSCs.Null,20只),MSCs.DCN PR 28d組(照射后28d尾靜脈注射MSCs.DCN,13只)和MSCs.Null PR 28d組(照射后28d尾靜脈注射MSCs.Null,13只)。在MSCs.DCN PR 6h(或MSCs.Null PR 6h)和MSCs.DCN PR 28d(或MSCs.Null PR 28d)組中,通過靜脈注射相應的基因修飾的MSC(1×106細胞/100μl PBS)。接著,我們對模型小鼠肺組織進行病理學分析。照射后28d和3個月,每組10只小鼠安樂死,取出肺組織。組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5μm厚的切片。HE染色觀察肺泡壁厚度,肺泡腔內炎性浸潤,肺泡充血,出血等病理組織學改變。此外,Masson染色檢測膠原沉積,并在數(shù)字成像顯微鏡下觀察。照射后28d,對照組,照射組,MSCs.DCN PR 6h組和MSCs.Null PR 6h組的肺組織按上述方法處理。分別用末端脫氧核苷酸轉移的UTP缺口末端標記(TUNEL)和Ki67染色檢查組織切片中的細胞凋亡和增殖。隨機選取5個視野(400×)計數(shù)陽性染色的肺泡上皮細胞,并計算凋亡率和增殖指數(shù)。實驗表明,局部接受單次20Gyγ射線照射后,急性期可見明顯的組織病理損傷,如炎細胞浸潤,肺泡壁破裂,肺泡間隔增厚,誘發(fā)肺泡上皮細胞凋亡。而γ射線照射也可在放療后3個月時引起肺纖維化。在急性炎癥階段,MSCs.DCN和MSCs.Null均能保護肺的結構,減輕炎癥浸潤,抑制放射誘導的上皮細胞凋亡,促進上皮細胞增殖。更重要的是,MSCs.DCN對放射引起的肺損傷具有更強的保護作用。在治療3個月后,Masson染色檢測肺泡,支氣管,血管膠原沉積。結果表明,兩組MSCs均能促進組織修復,有效保護肺臟結構,抑制纖維化。放射后較早期治療(放療后6h)在保護肺臟結構和抑制受損肺臟纖維化方面更為有效。而且,MSCs.DCN組對膠原沉積的抑制作用強于MSCs.Null組。最后,我們分析了MSCs.DCN介導的干預作用的可能機制。(1)檢測外周血中趨化因子和炎性細胞因子的表達:在照射后3d,7d,14d,28d和3m時,收集外周血樣品,制備血清。通過小鼠Th1/Th2和趨化因子組多因子檢測試劑盒來檢測外周血中IFN-γ、Eotaxin、RANTES、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-2和IP-10的表達情況。(2)肺組織局部炎性細胞因子和纖維化相關因子的表達:照射后28d和3m,收集小鼠肺組織,每組4只小鼠。提取總RNA,通過實時定量RT-PCR法檢測Decorin及其靶基因TGF-β和VEGFA,以及IL-10、IL-12、ICAM、TNF-α、IFN-γ、col1α1和col3α1等在m RNA水平的表達情況。(3)模型小鼠淋巴細胞免疫表型分析:照射后28d,采集外周血標本。用APC-CD3e,PE-CD4和FITC-CD8a標記血細胞,流式細胞術分析T淋巴細胞CD4+或CD8+細胞百分比。在照射后3d,7d,14d和28d,收集模型鼠外周血,用FITC-CD4,APC-CD25和PE-Fox P3標記細胞,用流式細胞術檢測CD4+T淋巴細胞中CD25+Fox P3+Tregs細胞的百分比。另外,照射后6h注射細胞組在照后28d取脾臟,制備單細胞懸液,如上所述標記細胞并通過流式細胞術分析。結果表明,MSCs治療減少了趨化因子和炎性細胞因子的表達,增加了外周血和局部肺組織中抗炎細胞因子的表達。有趣的是,在照射后3個月的肺組織中仍然可以檢測到MSCs.DCN介導的Decorin的表達,表明給予細胞治療后MSCs可歸巢并定植于受損的肺臟中。盡管MSCs.DCN和MSCs.Null均可有效下調Decorin靶基因,如轉化生長因子(TGF-β)和血管內皮生長因子A(VEGFA)的表達,但MSCs.DCN在誘導IFN-?表達,抑制肺組織中Col3α1的表達,以及減少外周血中調節(jié)性T細胞(Tregs)的比例方面較MSCs.Null更為有效。此外,研究結果還表明,與照射后較晚期治療組相比,在照射之后的急性期進行治療,其減輕炎癥和抑制纖維化方面效果更佳。綜上所述,DCN基因修飾的MSCs可以減輕照射所致的肺臟急性炎癥反應,并顯著抑制后期纖維化形成。DCN通過靶向促纖維化因子和Treg來增強MSCs的功能。因此,我們認為MSCs.DCN是一種治療RILI的有效策略。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.55
【圖文】：

重組腺病毒轉染 293 細胞后的鏡下變ull 和 Ad.DCN 經過擴增，用 CsCl 密度梯度離心法病毒純化示意圖（箭頭所指用紫外分光光度法檢測 OD260nm 和 的比值來計算病毒的純度，用 OD260

度梯度離心法病毒純化示意圖（箭頭所運用紫外分光光度法檢測 OD260nm m 的比值來計算病毒的純度，用 OD2示，病毒的顆粒滴度均在 1×1011vp/mL的純度要求。表明我們成功擴增了并純度和顆粒滴度符合下一步實驗的要表 1-3 重組腺病毒的純度與顆粒滴度顆粒滴度（vp/mL） 純1.21×10121.35.36×10111.3滴度，Ad.DCN 和 Ad.Null 的感染

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1 陳超維;謝小雪;婁繁;張榮;楊锫;楊敬儒;金和坤;;骨髓間充質干細胞移植預防放射性肺損傷及相關機制[J];湖南師范大學學報(醫(yī)學版);2018年03期

2 練祖平;謝有科;白廣德;;中醫(yī)藥防治放射性肺損傷的研究進展[J];廣西中醫(yī)藥;2018年04期

3 馮凱;左勇;沈丹;;非小細胞肺癌放療后有癥狀放射性肺損傷臨床特點分析[J];實用癌癥雜志;2017年02期

4 徐元元;戈偉;徐忠誠;;痰熱清注射液輔助治療肺癌急性放射性肺損傷及肺纖維化療效觀察[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志;2017年12期

5 徐元素;;血必凈注射液預防胸部惡性腫瘤放療中急性放射性肺損傷的臨床研究[J];中外醫(yī)學研究;2017年16期

6 林佳;;胸部腫瘤放療后致急性放射性肺損傷的相關因素分析[J];現(xiàn)代診斷與治療;2017年17期

7 張海靜;楊國儒;張紹坤;胡兆秋;李志杰;;血管緊張素轉換酶抑制劑對放射性肺損傷的臨床預防作用[J];濰坊醫(yī)學院學報;2015年05期

8 陳玉岳;張莉莉;;胸部腫瘤放療后致急性放射性肺損傷的臨床研究[J];中國醫(yī)藥指南;2015年34期

9 任晉進;張弓;張永康;;保肺抑纖湯抑制放射性肺損傷的臨床研究[J];中國藥物與臨床;2016年02期

10 王華;;還原型谷胱甘肽治療肺癌患者急性放射性肺損傷的療效分析[J];淮海醫(yī)藥;2016年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬力文;賈廷珍;;放射性肺損傷[A];全國醫(yī)用輻射防護與安全學術研討會論文匯編[C];2004年

2 杜雪梅;柳嘵蘭;崔玉芳;宋良文;孫啟鴻;;基因表達譜芯片分析放射性肺損傷早期差異表達基因[A];第七屆全軍防原醫(yī)學專業(yè)委員會第五屆中國毒理學會放射毒理專業(yè)委員會學術會議論文匯編[C];2004年

3 孫麗;宋良文;張勇;尹紀業(yè);;放射性肺損傷早期小鼠體內Ⅳ型膠原、MMP-9 TIMP-1 mRNA表達的變化[A];第六屆全國生物醫(yī)學體視學學術會議暨第九屆全軍軍事病理學學術會議、第五屆全軍定量病理學學術會議論文匯編[C];2005年

4 孫麗;宋良文;張勇;尹紀業(yè);;放射性肺損傷早期肺組織重建的機制研究[A];第六屆全國生物醫(yī)學體視學學術會議暨第九屆全軍軍事病理學學術會議、第五屆全軍定量病理學學術會議論文匯編[C];2005年

5 薛建新;李鑫;劉浩;敖睿;盧鈾;;基因修飾的骨髓間充質干細胞減輕小鼠放射性肺損傷[A];中華醫(yī)學會放射腫瘤治療學分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學術會議論文集[C];2009年

6 李而周;夏麗天;李瑩;孫黎明;吳斌;;放射性肺損傷與肺密度測定上的相關研究[A];中華醫(yī)學會放射學分會第八屆全國心胸影像學術大會暨河南省第十二次放射學術會議論文匯編[C];2006年

7 孟玲玲;馮林春;石懷銀;陳華;楊東;歐光明;陳新靜;崔迪;;苦參堿防治放射性肺損傷的實驗觀察[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術年會論文集[C];2007年

8 付成瑞;李寶生;徐恒衛(wèi);李洪升;張自成;張建波;郭斌;;山奈酚對小鼠放射性肺損傷防治作用的實驗研究[A];第八屆中國腫瘤學術大會暨第十三屆海峽兩岸腫瘤學術會議論文匯編[C];2014年

9 沈文斌;祝淑釵;李任;李娟;邱嶸;王玉祥;蘇景偉;;胸中下段食管癌三維適形放療所致放射性肺損傷相關因素分析3[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術年會論文集[C];2007年

10 張英杰;李建彬;盧潔;陳進琥;;非小細胞肺癌放療計劃修改對放射性肺損傷的影響[A];中華醫(yī)學會放射腫瘤治療學分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學術會議論文集[C];2009年

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1 衣曉峰;哈醫(yī)大發(fā)現(xiàn)射線對心肺的損傷和保護機制[N];中國醫(yī)藥報;2008年

2 哈爾濱醫(yī)科大學藥學院博士 張榮邋衣曉峰 陳英云 整理;放射性肺損傷機制新解[N];健康報;2008年

3 本報記者 鄭穎t

本文編號：2742065