發(fā)布時(shí)間：2020-07-01 18:30

【摘要】：DNA動(dòng)態(tài)過(guò)程的精確設(shè)計(jì)依賴(lài)于生物物理學(xué)方法和動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)。作為最簡(jiǎn)單的動(dòng)態(tài)DNA結(jié)構(gòu),短DNA雙鏈(9-12 nt)構(gòu)成短暫雜交方式,可用于超分辨成像和體外檢測(cè)。核酸底物上的核酸酶活性使得在分析化學(xué)和動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)中的各種應(yīng)用成為可能。核酸外切酶在細(xì)胞生物學(xué)中起著至關(guān)重要的作用,并以準(zhǔn)確的方式操控核酸。研究動(dòng)態(tài)底物與核酸外切酶的相互作用有助于開(kāi)發(fā)新的方法來(lái)設(shè)計(jì)特殊的分子行為并將動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞中。Lambda核酸外切酶不僅用于PCR產(chǎn)物處理,也是DNA分析方法與納米技術(shù)的衡量工具,由于其對(duì)錯(cuò)配的敏感性而受到廣泛應(yīng)用,然而其單核苷酸選擇性并不高,受DNA納米技術(shù)中用于提高特異性的動(dòng)態(tài)探針的啟發(fā),我們將熒光測(cè)驗(yàn)和單分子熒光分析相結(jié)合,利用Lambda核酸外切酶來(lái)探究它對(duì)短雙鏈DNA的單堿基選擇性。熒光測(cè)量結(jié)果表明,即使長(zhǎng)度小于酶足跡,短dsDNA也可被有效地消化,并且降解速率表現(xiàn)出高的單核苷酸選擇性。單分子分析表明,完全匹配(PM)底物可以有選擇性的結(jié)合酶,其與短底物短暫雜交的差異穩(wěn)定性結(jié)合以產(chǎn)生高的單核苷酸選擇性。單分子分析表明DNA短暫雜交和酶結(jié)合兩個(gè)平衡過(guò)程決定非平衡的消化過(guò)程,這兩種方法的協(xié)同作用提供了高的單核苷酸選擇性。本實(shí)驗(yàn)利用底物-酶相互作用,開(kāi)發(fā)了一種高度選擇性的單核苷酸突變檢測(cè)方法,可以從低豐度的細(xì)胞系中檢測(cè)到KRAS突變,該方法能夠檢測(cè)到的突變低至0.1%。
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R440;O657.3
【圖文】：

如先前報(bào)道的，由于錯(cuò)配位置不同，短的雙鏈ＤＮＡ的平衡常數(shù)可以從１０２變逡逑化至１０５ｎＭ。首先經(jīng)過(guò)ＮＵＰＡＣＫ軟件預(yù)分析，我們選定了邋４個(gè)位置來(lái)進(jìn)行錯(cuò)配位點(diǎn)逡逑的修改，我們?cè)冢保玻猓疱澹校偷孜锏牟煌恢靡肓隋澹茫海铃e(cuò)配。從圖２－２的ＤＦ值我們可逡逑以看出當(dāng)錯(cuò)配位于不同位置時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的ＤＦ值。位于中間的錯(cuò)配動(dòng)態(tài)底物表現(xiàn)出逡逑最低的反應(yīng)速率。通過(guò)將錯(cuò)配轉(zhuǎn)移到最后，催化活性逐漸復(fù)。這一結(jié)果與先前的觀察逡逑結(jié)果一致，即當(dāng)接近雙鏈體中部時(shí)，錯(cuò)配對(duì)雙鏈體穩(wěn)定性有更大的負(fù)面影響。雖然核逡逑酸外切酶的催化活性可能對(duì)錯(cuò)配附近的堿基敏感，但區(qū)分度因錯(cuò)配位置不同而不同，逡逑主要由雙鏈體穩(wěn)定性的變化引起。本實(shí)驗(yàn)探究了不同位點(diǎn)單堿基突變對(duì)于短暫雜交體逡逑系區(qū)分度的影響，第９位的突變區(qū)分度優(yōu)于其他位點(diǎn)，因此我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以第９位逡逑點(diǎn)突變開(kāi)展探究。逡逑１４逡逑

活性的動(dòng)力學(xué)都可以通過(guò)一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于寡核苷酸是聚陰離子的，逡逑加入陽(yáng)離子（例如Ｎａ＋，邋Ｍｇ２。可以增強(qiáng)兩條鏈之間的結(jié)合力。ＮａＣｌ通常用于調(diào)節(jié)逡逑ＤＮＡ雙鏈體的穩(wěn)定性，因此我們研宄了邋ＮａＣｌ對(duì)單核苷酸鑒別能力的影響。如圖２－４，逡逑體系中ＮａＣｌ終濃度分別為ＯｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ，我們看到在沒(méi)有鹽離逡逑子存在的情況下，兩個(gè)靶信號(hào)探針雙鏈體的穩(wěn)定性較弱，而ＮａＣｌ的引入對(duì)于區(qū)分度逡逑的提高有很多大幫助，５０ｍＭＮａＣｌ的引入使得區(qū)分度能上升到１０００以上，完全互補(bǔ)逡逑型與錯(cuò)配型雙鏈的降解速率都增加，這主要是由于隨著溶液離子強(qiáng)度的增加，完全互逡逑補(bǔ)型的雙鏈體相比于錯(cuò)配型的信號(hào)增加得更多，因此它們之間的ＤＦ值進(jìn)一步增加。逡逑除此之外，我們從圖２－４中看出，１００邋ｍＭ邋ＮａＣｌ調(diào)節(jié)的體系的ＤＦ值降低，因?yàn)楦邼忮义隙龋危幔茫鞂?duì)酶的活性產(chǎn)生了影響，從而導(dǎo)致ＤＦ的降低，因此我們選取５０邋ｍＭ邋ＮａＣｌ逡逑作為體系離子調(diào)節(jié)來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑１６逡逑

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本文編號(hào)：2737118