【摘要】：乙型肝炎是全球關(guān)注的傳染病之一,是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致。有研究表明,HBV表面大蛋白前S1區(qū)(PreS1)在病毒感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用,因此,針對(duì)PreS1的抗體檢測受到廣泛關(guān)注。目前特異性抗體主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測,但由于乙型肝炎患者群感染的HBV基因序列復(fù)雜多變,臨床實(shí)際應(yīng)用仍缺乏精確有效的抗體檢測方法。本研究應(yīng)用分子仿生學(xué)思想,以人體內(nèi)多克隆抗體的抗體存在環(huán)境為仿生原型,旨在基于前期利用多基因型肽段組合包被檢測患者PreS1 94 117表位抗體(P94抗體)的研究基礎(chǔ),通過PreS1關(guān)鍵表位(21 47和94 117表位)肽段的組合包被模擬PreS1全長包被,檢測PreS1抗體,為后續(xù)通過多基因型多表位肽段組合模擬大樣本乙型肝炎患者群中HBV的復(fù)雜基因序列狀態(tài),開發(fā)適用于大樣本群抗體檢測的商品化試劑盒奠定基礎(chǔ)。本研究首先通過對(duì)中國乙型肝炎患者群的基因分型研究,創(chuàng)新性地建立了一種基于關(guān)鍵表位氨基酸序列的基因分型方法。隨后通過優(yōu)化肽段組合包被方式,建立了仿生肽段組合檢測P94抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assays,ELISA),并分別利用B和C基因型的P94肽段作為抗原,通過小鼠免疫法制備了三種針對(duì)不同基因型應(yīng)答不同的單克隆抗體,作為定量化檢測抗體的標(biāo)準(zhǔn)品。然后利用上述建立的ELISA方法檢測了大量乙型肝炎患者血清樣本中的P94抗體,對(duì)P94抗體含量與乙型肝炎患者HBV DNA載量和患病階段進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。最后驗(yàn)證了組合包被PreS1兩關(guān)鍵表位肽段檢測抗體與包被全長蛋白檢測抗體結(jié)果之間的一致性,為臨床應(yīng)用提供了支持。主要研究結(jié)果如下:(1)研究HBV基因分型。本文成功地對(duì)232例乙型肝炎患者進(jìn)行了病毒測序分型,創(chuàng)新性地建立了基于氨基酸序列的基因分型方法,為利用關(guān)鍵表位的ELISA基因分型方法研究提供了理論依據(jù)。(2)建立并優(yōu)化了P94抗體的ELISA檢測方法。本文進(jìn)一步優(yōu)化了肽段組合檢測P94抗體的包被濃度和方式,確定包被方式為B和C基因型P94肽段組合包被,其包被濃度為各5μg/mL。對(duì)單一包被B基因型、單一包被C基因型和組合包被兩種基因型,這三種不同包被方式的ELISA檢測方法進(jìn)行分析,組合包被檢測的平均變異系數(shù)顯著低于單B或單C包被檢測的平均變異系數(shù),且具有較高的一致性,說明肽段組合包被的抗體檢測方法重復(fù)性好且準(zhǔn)確性高。(3)開發(fā)單克隆抗體以實(shí)現(xiàn)抗體檢測定量化。本文制備了三種針對(duì)不同基因型應(yīng)答不同的單克隆抗體,分別為對(duì)B和C基因型均應(yīng)答的單抗B11、只對(duì)B基因型應(yīng)答的單抗B19和只對(duì)C基因型應(yīng)答的單抗C04,確定了陽性判斷值,可實(shí)現(xiàn)P94抗體定量化檢測。(4)分析了P94抗體與HBV DNA載量和患病階段之間的相關(guān)性。本文檢測了631例乙型肝炎患者血清中的P94抗體,并對(duì)乙型肝炎患者的P94抗體濃度、患病階段以及HBV DNA載量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明,當(dāng)P94抗體為陽性時(shí),P94抗體隨著HBV DNA載量的升高而逐漸增加,但隨著患者病情逐漸加重呈下降趨勢。(5)建立了兩表位肽段組合檢測PreS1抗體的方法。本文對(duì)比了四種不同的包被方式(包被PreS1全長、單一包被P21表位肽段、單一包被P94表位肽段、組合包被P21和P94表位肽段)的抗體檢測結(jié)果,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果表明PreS1關(guān)鍵表位肽段的組合包被可有效地替代全長蛋白來實(shí)現(xiàn)PreS1抗體檢測。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.62;R446.6
【圖文】：

吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文優(yōu)化了 P94 抗體的 ELISA 檢測體系以及基于關(guān)鍵表位肽段組合包被的間接ELISA 抗體檢測體系，并開發(fā)了針對(duì)不同基因型應(yīng)答的單克隆抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品，以實(shí)現(xiàn)定量化抗體檢測[49]。這種組合關(guān)鍵表位多肽包被的 ELISA 檢測方法可以替代單一關(guān)鍵表位肽段或 PreS1 全長蛋白檢測 PreS1 抗體，其檢測靈敏度和準(zhǔn)確性較高，并且具有可以適應(yīng)臨床抗體檢測應(yīng)用的簡便性和可操作性，因此，本研究在 HBV 抗體檢測和乙型肝炎防治領(lǐng)域具有良好的前景。

圖 1.2 單克隆抗體制備原理術(shù)制備得到的單克隆抗體具有高親和力、高靈敏度以廣泛用于物質(zhì)的檢測和分離工作。但鼠源性抗體和治療方面的應(yīng)用中存在了一定的缺陷，主要因?yàn)槭竺娴?Fc 段手提親和力較差，其分泌的抗體依賴性細(xì)強(qiáng)，而且它與人補(bǔ)體成分的結(jié)合效果一般，因此與十分有限[74,75]�；蚬こ炭贵w技術(shù)制備單克隆抗體抗體技術(shù)包括很多種類型，包括嵌合抗體技術(shù)、重術(shù)、核糖體展示技術(shù)和基因工程小鼠制備抗體技術(shù)雜交瘤技術(shù)制備得到的鼠源單克隆抗體在臨床治療原（MHC）和超敏反應(yīng)等問題，研究人員尋求利用

【參考文獻(xiàn)】

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1 王貴強(qiáng);王福生;成軍;任紅;莊輝;孫劍;李蘭娟;李杰;孟慶華;趙景民;段鐘平;侯金林;賈繼東;唐紅;盛吉芳;彭R

本文編號(hào)：2730953