發(fā)布時間：2020-06-19 18:55

【摘要】：目的:在全球范圍內(nèi),呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一種引起嬰幼兒下呼吸道感染常見的病毒病原體,給社會造成了巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟負擔。重組酶介導等溫核酸擴增技術(Recombinase Aided Amplification,RAA)是具有我國自主知識產(chǎn)權的等溫核酸快速檢測技術。RAA擴增產(chǎn)物的檢測可分為熒光法和側流層析試紙條法(Lateral Flow Dipstick,LFD)。本研究旨在建立兩種方法實現(xiàn)呼吸道合胞病毒的快速檢測,一種為含有內(nèi)參的雙重實時熒光逆轉錄重組酶介導等溫核酸擴增技術(IC-rtRAA),另一種是將RAA技術與LFD相結合的LFD-rtRAA技術。評價該兩種檢測方法的靈敏度和特異性,并分別應用于臨床標本的檢測,進行臨床標本檢測效能的評價。方法:本研究從美國國立生物技術信息中心(NCBI)中下載RSV病毒的全基因序列,并利用Vector NTI軟件進行序列比對,找出其保守區(qū)(靶基因區(qū))。1.IC-rtRAA檢測方法:根據(jù)RAA引物探針設計原則,并針對比對出的保守區(qū)設計引物和探針數(shù)條,隨后篩選出最優(yōu)的引物探針組合。在本實驗中,首先建立了單重實時熒光逆轉錄重組酶介導等溫核酸擴增技術(Singleplex-rtRAA),隨后在此基礎上加入內(nèi)參,建立了含有內(nèi)參的雙重實時熒光逆轉錄重組酶介導等溫核酸擴增技術(IC-rtRAA)。2.LFD-rtRAA檢測方法:根據(jù)RAA-LFD引物探針的設計原則,設計了適用于LFD-rtRAA法的引物探針,并進行相應的修飾,建立了LFD-rtRAA檢測方法。用含有靶基因的重組質粒標準品對此兩種方法進行靈敏度的評價;用其他常見呼吸道病毒進行特異性的評價;分別利用已建立好的IC-rtRAA檢測方法和LFD-rtRAA檢測方法與文獻報道的RT-qPCR方法同時檢測278份臨床標本,計算Kappa值,進行檢測結果一致性比較,評估該兩種方法的臨床檢測效能。結果:1.IC-rtRAA法的分析靈敏度為5.0拷貝/反應,未與其他常見呼吸道病毒發(fā)生交叉反應,特異性良好。采用該方法檢測278例臨床標本,結果與RSV RT-qPCR分析結果完全一致。2.LFD-rtRAA法可檢測到的最低RSV質粒濃度為10拷貝/反應,未與其他常見呼吸道病毒發(fā)生交叉反應,特異性良好。采用該方法檢測278例臨床標本,結果與IC-rtRAA法和RSV RT-qPCR分析結果完全一致。結論:本研究建立的兩種RAA檢測方法在快速檢測RSV方面具有很大的應用潛力,簡便快速且具有較高的靈敏度和特異性,為呼吸道合胞病毒的檢測提供了新工具。IC-rtRAA檢測方法中內(nèi)參的引入,保證了檢測結果的準確性,有利于其在臨床上的應用,且內(nèi)參設計中所采取的策略對基于RAA的檢測技術的實際應用具有一定的參考價值。LFD-rtRAA檢測方法更適用于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)或現(xiàn)場快速檢測。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R511;R440
【圖文】：

LFD-rtRAA法nfo探針和擴增產(chǎn)物的結構示意圖

【參考文獻】

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本文編號：2721207