【摘要】：研究背景:慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)是引起異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)患者無復發(fā)死亡最常見并發(fā)癥,可累及全身各個組織和器官,并且嚴重影響allo-HSCT長期存活患者的生存質量和重返社會的能力[1,33]。約30%-70%的allo-HSCT患者會發(fā)生cGVHD[2,15]。目前,由于cGVHD的免疫細胞和分子機制尚不明確,因此對cGVHD的有效預防與治療進展緩慢。既往,對于參與cGVHD病理過程的免疫細胞的研究一般采用流式細胞技術。傳統(tǒng)流式細胞儀,是基于熒光發(fā)射的檢測系統(tǒng),不同的熒光基團發(fā)射光譜存在重疊現(xiàn)象,因此,目前可同時檢測的熒光信號標記一般少于15個,同時信號標記之間容易互相干擾,這在一定程度上影響了實驗的準確性。目前新興的質譜流式細胞技術(cytometry by time-of-flight,CyTOF)),以在細胞中含量極低的鑭系金屬代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光蛋白來標記抗體,由于無需校正光譜的重疊干擾,可以同時檢測單個細胞的最多100個標記,因此成為研究復雜免疫系統(tǒng)的有效手段。通過質譜流式細胞技術,我們能夠從廣度、深度研究參與cGVHD病理生理過程的免疫細胞亞群及其相應特征,為進一步揭示慢性移植物抗宿主病的發(fā)病機制提供新思路。目的:本研究為明確cGVHD患者的免疫細胞圖譜,通過質譜流式技術深入分析免疫細胞亞群失衡在慢性移植物抗宿主病發(fā)生發(fā)展中的作用,從而進一步探索靶向特定免疫機制的慢性移植物抗宿主病治療新策略。方法:(1)確定單細胞質譜流式細胞技術實驗所需的42種免疫標記,初步構建上機方案,前期采集檢測樣本,單細胞質譜流式細胞儀進行分析,檢測抗體質量,質檢通過后正式構建慢性移植物抗宿主病CyTOF檢測人體免疫試劑盒(包含42種CyTOF抗體,包括T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞、DC細胞、漿細胞和粒細胞、髓系細胞等細胞亞群標記);(2)接受allo-HSCT患者按照NIH診斷及分型標準分為無cGVHD患者組、中度cGVHD患者組、重度cGVHD患者組,同時按照病人cGVHD累及器官分為以皮膚cGVHD癥狀為主患者組和以肺部cGVHD癥狀為主患者組;(3)臨床上收集異基因造血干細胞移植術后患者外周血標本31例,記錄詳細病程信息,同時收集健康捐獻者外周血標本5例,所有參與研究者均需排除感染情況和自身免疫性疾病,空腹抽取靜脈血10ml,EDTA抗凝,24小時內密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,每個待檢測樣本選取3×106個外周血單個核細胞染色質譜流式上機檢測,剩余細胞-80攝氏度冰箱冷凍24小時后轉入液氮中保存;(4)上機檢測所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,進行后續(xù)實驗。生物信息學方法:(1)原始數(shù)據(jù)預處理及質量控制:對數(shù)據(jù)進行標準化預處理,并去除批次等噪音影響,得到單個、活的、免疫細胞的有效數(shù)據(jù)進行下一步分析;(2)聚類分析:選擇上機方案中指定的信號標記,采用xshift聚類算法進行分析;當單個文件細胞數(shù)量過大時,對數(shù)據(jù)采用隨機降采樣的方法以減少細胞數(shù)并同時不加入人為操作偏差。通過高性能的聚類算法獲得對樣本的免疫細胞亞群的分類(cluster);(3)聚類結果統(tǒng)計學分析及可視化展示:采用基于t分布隨機領域嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)的降維可視化方法對所獲得的聚類結果進行可視化,并獲得可視化隨機網絡嵌入(visual stochastic network embedding,viSNE)、熱圖(heatmap)等可視化展示;同時,對各樣本中每個亞群的百分比(Frequency)進行差異性分析,根據(jù)病人臨床信息,對樣本進行分組,采用雙邊t檢驗的方法確認不同組別之差異性表達的特征免疫亞群。結果:(1)自2017年11月-2018年12月共收集31例異基因造血干細胞移植后患者外周血樣,其中12例患者未發(fā)生cGVHD,7例患者發(fā)生中度cGVHD,12例患者發(fā)生重度cGVHD。在19例發(fā)生中度-重度cGVHD患者中,10例患者以皮膚cGVHD癥狀為主要臨床表現(xiàn),6例患者主要表現(xiàn)為肺部cGVHD癥狀,3例患者同時出現(xiàn)皮膚與肺部cGVHD癥狀;(2)通過質譜流式檢測各分組患者外周血單個核細胞的細胞亞群組成和免疫表型,我們發(fā)現(xiàn),中-重度cGVHD患者組與無cGVHD患者組相比,具有不同的細胞亞群分布圖譜;(3)以肺部癥狀為主cGVHD患者組與無cGVHD患者組相比,具有不同的細胞亞群分布圖譜;(4)以皮膚癥狀為主cGVHD患者組與無cGVHD患者組相比,具有不同的細胞亞群分布圖譜;(5)中度cGVHD患者的外周血中骨髓來源抑制細胞的比例高于無cGVHD患者組,重度cGVHD患者的外周血中單核吞噬細胞的比例高于無cGVHD患者組;(6)以肺部癥狀為主cGVHD患者的外周血中兩群特異的T細胞亞群(C5,C21)的比例高于無cGVHD患者組和以皮膚癥狀為主cGVHD患者組;(7)小鼠異基因骨髓移植模型構建后流式細胞術檢測移植嵌合度,得到H2-Kb陽性細胞所占百分比超過90%,檢測結果為完全嵌合,小鼠異基因骨髓移植模型建立成功;(8)小鼠cGVHD模型流式檢測發(fā)現(xiàn)cGVHD嚴重程度與外周血CD11b+髓系細胞群的比例成正相關關系。結論:(1)骨髓來源抑制細胞與單核吞噬細胞可能與cGVHD的病理機制有關;(2)兩群T細胞亞群可能參與肺部cGVHD的病理過程;(3)小鼠cGVHD模型證實CD11b+髓系細胞群可能與cGVHD的病理機制有關。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R457.7
【圖文】：

ｃＧＶＨＤ患者組相比具有不同的細胞亞群分布圖譜逡逑通過ＣｙＴＯＦ檢測發(fā)現(xiàn)６例以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者與１２例無ｃＧＶＨＤ逡逑患者相比，外周血單個核細胞具有不同的細胞亞群分布圖譜（圖２）。逡逑ＡＢＣ逡逑圖２，無ｃＧＶＨＤ患者組與以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析后ｖｉＳＮＥ對比。圖Ａ為逡逑無ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｂ為以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析逡逑后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｃ為無ｃＧＶＨＤ患者組與以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析后ｖｉＳＮＥ逡逑對比圖�？赏ㄟ^對比發(fā)現(xiàn)部分差異細胞亞群。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２

逡逑ｃＧＶＨＤ患者相比，外周血單個核細胞具有不同的細胞亞群分布圖譜（圖３）。逡逑ＡＢＣ逡逑圖３，無ｃＧＶＨＤ患者組與以皮膚癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析后ｖｉＳＮＥ對比。圖Ａ為逡逑無ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｂ為以皮膚癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析逡逑后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｃ為無ｃＧＶＨＤ患者組與以皮膚癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類分析后ｖｉＳＮＥ逡逑對比圖�？赏ㄟ^對比發(fā)現(xiàn)部分差異細胞亞群。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ３

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本文編號：2716049