【摘要】：基因變異最常見的形式是單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism,SNP),它與人類疾病、藥物效率有密切聯(lián)系。SNP檢測(cè)已被認(rèn)為是早期診斷惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有前途的工具。全面了解單核苷酸多態(tài)性基因分型可以實(shí)現(xiàn)有價(jià)值的信息,并用來指導(dǎo)臨床診斷和個(gè)體用藥的發(fā)展,所以,簡(jiǎn)單、精準(zhǔn)的SNP檢測(cè)是非常重要的。由于較低的商業(yè)成本以及核酸底物識(shí)別的靈活性,T4 DNA連接酶被廣泛應(yīng)用于生物分子工程,特別是特定核酸序列的等位特異性連接檢測(cè)。本論文探究了以T4 DNA連接酶為主的不同連接酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)中引入額外的錯(cuò)配對(duì)于目的基因片段上的單堿基變異位點(diǎn)的識(shí)別所產(chǎn)生的影響。論文以鎖式探針成環(huán)反應(yīng)為模型,系統(tǒng)性地驗(yàn)證了不同DNA連接酶的連接活性,分析了引入額外錯(cuò)配對(duì)連接酶特異性的影響。研究結(jié)果表明,引入額外的堿基錯(cuò)配,提高了T4 DNA連接酶對(duì)單堿基變異的目的核酸的特異性。對(duì)單堿基DNA突變檢測(cè),分析發(fā)現(xiàn)在連接點(diǎn)相鄰位置引入額外的錯(cuò)配,可以明顯提高T4 DNA連接酶的特異性。其中,最有效的錯(cuò)配堿基對(duì)可使T4 DNA連接酶的特異性提高600多倍。對(duì)單堿基RNA突變檢測(cè),分析發(fā)現(xiàn)對(duì)不同堿基檢測(cè)時(shí),額外引入錯(cuò)配的最佳位置不同,且T4 DNA連接酶對(duì)于DNA底物的識(shí)別靈敏度高于RNA/DNA復(fù)合底物的識(shí)別。此外,還對(duì)Taq DNA連接酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明額外引入的錯(cuò)配對(duì)于Taq DNA連接酶對(duì)底物識(shí)別的特異性影響不大。本論文從不同連接酶的連接效率、對(duì)不同底物的識(shí)別特異性進(jìn)行研究,確認(rèn)了額外引入的錯(cuò)配可以提高T4 DNA連接酶對(duì)底物識(shí)別的特異性,提高了單堿基突變檢測(cè)的精準(zhǔn)度。所得結(jié)論對(duì)以鎖式探針為模型的特異性核酸位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)有指導(dǎo)意義,同時(shí)對(duì)發(fā)展臨床診斷技術(shù)和個(gè)體化用藥有推進(jìn)作用。
【圖文】：

并用來指導(dǎo)臨床診斷和個(gè)體用藥的發(fā)展[12]。序列檢測(cè)技術(shù) SNP 的檢測(cè)技術(shù)有很多，但主流的技術(shù)大致可以、測(cè)序技術(shù)、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。 PCR 技術(shù) PE-Cetus 公司發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚in reaction, PCR），它是一種應(yīng)用十分廣泛的體外括：DNA 模板、一對(duì)引物、dNTPs、熱穩(wěn)定的聚、退火和延伸（圖 1-1）。高溫變性是使 DNA 雙引物結(jié)合到單鏈上；延伸是聚合酶發(fā)揮作用。

要求不高的定量 PCR 檢測(cè)。性熒光探針法是在 PCR 反應(yīng)體系內(nèi)添加一對(duì)引物的同時(shí)，加入一種特異性的探針序列，從而通過檢測(cè)加入的熒光信號(hào)來定性。熒光探針：一是探針本身帶有強(qiáng)烈熒光的熒光分子，通過結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與淬aqman 探針；另一種是探針帶有可以通過與核酸的結(jié)合改變自分子，如 LightUp 探針。n 探針（圖 1-2）是一段寡核苷酸序列，它的 5’端帶有熒光基基團(tuán)。因淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)距離較近，，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光儀器不能檢測(cè)到信號(hào)。但是當(dāng)探針與目標(biāo)序列結(jié)合，PCR 延所結(jié)合位置時(shí)，因 Taq DNA 聚合酶有 5’-3’的外切酶活性，會(huì)aqman 探針降解，從而使熒光分子與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光檢測(cè)到熒光信號(hào)并進(jìn)行收集、分析[14; 15]。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R440

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本文編號(hào)：2707806