【摘要】：在世界范圍內,由腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovor Entteritidis,S.Enteritidis)導致的沙門菌病是一種重要的食源性傳染病。腸炎沙門菌能夠導致禽類的發(fā)病及死亡,在感染種雞后,常表現(xiàn)為隱性帶菌而不發(fā)病,該菌能夠感染人類和其他多種動物,是一種重要且危害嚴重的人獸共患病原菌�？咕幬锏氖褂檬欠乐文c炎沙門菌感染的重要手段之一,而腸炎沙門菌耐藥性的產生和傳播則極大地制約了抗菌藥物的使用效果。耐藥基因的產生和傳播是腸炎沙門菌耐藥性的重要分子機制之一,高通量測序技術的發(fā)展和突破為研究耐藥性的分子機制提供了極大的便利。本研究通過對190株腸炎沙門菌的全基因組重測序研究,探討高通量測序技術在腸炎沙門菌耐藥性研究中的應用,分析我國腸炎沙門菌的分子耐藥機制和演化規(guī)律。一、腸炎沙門菌的生物辨識利用生物信息學技術對190株分離菌株的全基因組測序raw reads進行質量控制與拼接,得到組裝長序列,將最終assembly文件作為全基因組數(shù)據(jù)材料進行后續(xù)分析。首先使用MicrobeTrakr在線工具鑒定種屬,190株測序菌株均為沙門菌屬。然后使用sistr_cmd軟件鑒定測序菌株血清型,均為腸炎沙門菌。最后使用PubMLST工具鑒定其ST型,除SAL0000131和SAL0000132兩株為新型以外,其余均為ST11,符合腸炎沙門菌的ST型特征,而SAL0000131和SAL0000132的aroC基因的突變是導致該兩株菌株表現(xiàn)為新ST型的原因。二、腸炎沙門菌的耐藥基因與耐藥性對190株腸炎沙門菌進行耐藥表型測定,腸炎沙門菌對NAL的耐藥率最高,為83.7%,對 AMP 和 AMC 的耐藥性分別達到 62.6%和 62.1%,對 CFZ(41.6%)、STR(45.8%)、SXT(29.5%)和TET(21.6%)的耐藥菌株也較多,其他藥物的耐藥菌株數(shù)量較少,AMK甚至沒有任何菌株表現(xiàn)為耐藥。在不同宿主中,43株人源腸炎沙門菌不僅有非常寬的耐藥譜,其耐藥水平也相當高,整體耐藥情況最復雜,多重耐藥率達到65.1%,且多重耐藥菌株的耐藥譜非常寬,其中NAL耐藥率最高,達到81.4%;對AMP、AMC和CFZ的耐藥率均超過50%,分別達到62.8%、65.1%和53.5%;對ATM和STR的耐藥率較高,分別達到23.3%和 37.2%;對 KAN、GEN、TET、SXT、CHL 和 OLA 的耐藥率較低,分別達到 16.3%、16.3%、16.3%、11.6%、11.6%和 9.3%;CIP 和 ENR 的耐藥率僅有 2.3%和 4.7%;對 MEM、AMK和NIT無耐藥菌株。雞源腸炎沙門菌耐藥譜較寬,耐藥率較高,耐藥水平較高,整體耐藥情況較為復雜,其中NAL耐藥率最高,為94.3%,MIC50達到512μg/ml;其次為AMP、AMC、CFZ 和 STR,耐藥率分別達到 69.9%、68.3%、42.3%和 52.0%;SXT 和 TET的耐藥率較高,分別為31.7%和25.6%;其余藥物的耐藥率則較低,均不超過10%;AMK沒有任何耐藥菌株。其余宿主腸炎沙門菌數(shù)量較少,其耐藥率遠低于人源與雞源腸炎沙門菌。使用blast軟件將組裝序列與ResFinder數(shù)據(jù)庫比對,共檢測到50種耐藥相關基因,分別為 aadA1、aadA2、aadA5、aadA16、aadA22、aac(6')Ib-cr、aac(3)-Iva、aac(3)-IId、aph(3')-IIa、aph(3)-Ia、aph(3')-Ic、aph(4)-la、aph(3)-Iva、arr-3、blaTEM-1、blaCTx-M-3、blacrx-M-14、blaCTX-M-55、blacTX-M-65、blaoXA-1、blaNDM-5、blaMIR-2、blaMIR-6、blacMY-2、catA1、catB、catB3、cmlA1、dfrA1、dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27、ermB、fosA、floR、lnuF、mefB、mphA、oqxA、oqxB、qnrA7、strA、sul2、sul1、sul3、tetA、tetB和tetC。去除相似度低于80%和覆蓋度低于70%的基因,得到與表型試驗相關的耐藥基因共計35種,分別為β-內酰胺類耐藥相關基因 7 種(bfaTEM-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaoXA-1和blaCMY-2),氨基糖苷類耐藥相關基因13種(strA、strB、aadA1、aadA4、aadAB、aadA16、aadA22、aac(3)-IId、aph(3')-Ila、aph(3')-Ia、aph(4)-Ia、aph(3)-Iva和aac(6')Ib-cr),喹諾酮類耐藥相關基因3種(qnrA7、oqxA、oq萬),四環(huán)素類耐藥相關基因2種(tetA和tetC),磺胺類耐藥相關基因3種(sul1、sul2和sul3),三甲氧芐二氨嘧啶類相關耐藥基因3種(dfrA1、dfrA17和dfrA27)以及酰胺醇類耐藥相關基因4種(catB3、catB、floR和cmLA1)�；蛐团c表型對應關系良好,blaTEM-1基因與青霉素類藥物AMP和AMC的對應率達到96.1%和95.1%,strA基因和strB基因與氨基糖苷類藥物STR的對應率達到90.9%,tetA基因與四環(huán)素類藥物四環(huán)素對應率達到82.9%,dfrA17基因與磺胺類藥物復方新諾明的對應率達到88.9%,catB3、catB、floR和cmlA1與酰胺醇類藥物CHL對應性達到了 100%,均表現(xiàn)出優(yōu)良的對應性,但仍然存在表型與基因型不對應的情況,說明仍然有未知的耐藥機制在發(fā)揮作用�；虻狞c突變研究顯示,基因點突變確實能夠影響耐藥表型。blarEM-1基因的A120C突變在6株腸炎沙門菌中被檢測到,該6株菌株中的5株表現(xiàn)出頭孢唑林的高耐藥表型(MIC≥512μg/ml)。strA中檢測到2種非共有點突變(C295T和G445C),未發(fā)現(xiàn)其對表型存在顯著影響。strB檢測到11種非共有點突變(A139G、T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C、G364C、T535G、G592T 和 G574T),其中 T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C和G364C在基因序列上的位置相當接近。tetA基因中共檢測到10中非共有點突變,其中發(fā)生A124G突變的YZU0232和YZU0266的四環(huán)素耐藥表型均為不耐藥,該突變可能對tetA基因功能有減弱作用,發(fā)生G250A(SAL0000212和YZU0228)和G277A(YZU0254)的菌株表現(xiàn)出的MIC水平達到耐藥突破點的8倍,該兩種點突變可能對耐藥性有提高作用。喹諾酮類藥物的耐藥性產生與QRDR的點突變具有關聯(lián),并且由于各基因之間、各點突變之間的相互配合導致不同的耐藥表型和水平。在質粒檢測分析中發(fā)現(xiàn)IncX1型質粒攜帶有眾多耐藥基因,可能與腸炎沙門菌的耐藥流行有密切關聯(lián)。對不同質粒所攜帶的耐藥基因進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)95個IncX1型質粒攜帶了 77個strA基因中的76個、77個strB基因中的76個、77個sul2基因中的76個、35個tetA基因中的31個和103個blaTEM-1基因中的95個,IncX1型質粒主要攜帶的基因為str4、strB、sul2、tetA和blaTEM-1,與氨基糖苷類、磺胺類、四環(huán)素類和β-內酰胺類抗生素的耐藥性相關,而其余質粒均不攜帶耐藥基因,顯示IncX1型是腸炎沙門菌耐藥基因流行的關鍵性可移動元件。三、腸炎沙門菌的進化與耐藥性研究使用Parsnp軟件對190株腸炎沙門菌作核心基因組進化樹,并與背景信息對應分析。MIC表型、耐藥基因型和質粒分型在進化關系上呈現(xiàn)出明顯的譜系差異,核心基因組進化樹的構建所產生的不同分支能夠與耐藥相關背景信息較為準確清晰的對應。使用Parsnp軟件對國內外共計208株腸炎沙門菌進行核心基因組進化樹構建,結果顯示國內菌株與美國、加拿大、韓國、莫斯科、丹麥和巴西的菌株在進化樹上可以明顯區(qū)分,國外菌株處于獨立分支且能夠按照宿主和年代來源形成較為明確的譜系。國內腸炎沙門菌的流行則由兩部分組成,其一為國內流行的腸炎沙門菌,其二可能是來自于美國和加拿大等北美國家的腸炎沙門菌。根據(jù)國內外菌株的進化關系對比分析,國內腸炎沙門菌的進化結構比國外菌株更為復雜,國內各宿主、地區(qū)的腸炎沙門菌在進化關系上非常接近,而非國外菌株所表現(xiàn)出的不同譜系,可能意味著國內腸炎沙門菌的流行范圍更大,宿主間的菌株交流更頻繁�；谌蚪M重測序的進化分析在一定程度上能夠對腸炎沙門菌耐藥性作出預測和指導。
【圖文】：

序深度邐圖１文庫構建示意圖逡逑，對后邐Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｐ—ａｒａｔｉｏｎ逡逑讀長以１５0ｂｐ或２５０ｂｐ為常用。逡逑示。測序反應在邋ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ邋中進行，ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ逡逑碎后的短序列片段。短片段通過ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ逡逑合在ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ中的ｌａｎｅ上。每個ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ逡逑ｎｅ，能夠同時■并彳亍的進彳亍測序反應。使用逡逑酶進行ＰＣＲ反應，待測片段經過重復擴增，逡逑片段，通過變性操作使雙鏈片段解鏈成為逡逑且再錨定到固相表面的其他區(qū)域，根據(jù)需逡逑數(shù)，于是在ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ中得到大量雙鏈待測逡逑ａｎｅ的總表面積。逡逑

邐基于全基因組重測序的（Ａ）文庫的構建（Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）逡逑如圖１所示。將基因組打斷成為短序列片在片段的兩頭連接上特定的接頭（Ａｄａｐｔｏｒ），人工設計的堿基序列，發(fā)揮錨定功能。若為轉錄則需要首先對序列進行反轉工作。片段的大ｓｉｚｅ）將會直接影響后續(xù)的信息學分析，故而組測序，首先要確定片段化的大小，從而使得段組裝（Ａｓｓｅｍｂｌｙ）工作更加準確。在固定的下，過長的測序讀長會導致測序序列的質量下續(xù)組裝和信息學工作帶來困難，，因此目前的測（Ｂ）簇擴增（ＣｌｕｓｔｅｒＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）逡逑Ｃｌｕｓｔｅｒ邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邐如圖邋２邋功能為結合
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

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本文編號：2702575