【摘要】：臨床化學(xué)毒物按照毒性為可分為劇毒、高毒、中毒、低毒和微毒五個(gè)等級(jí),其數(shù)量龐大,僅劇高毒物質(zhì)就有5000余種,種類繁多,涉及領(lǐng)域廣泛。在我國(guó),每年鼠藥、農(nóng)藥、鎮(zhèn)靜催眠藥、植物有毒成分等化學(xué)毒物的誤服、蓄意投毒所造成的臨床中毒事件屢有發(fā)生,對(duì)公共安全和人身健康造成極大威脅�；瘜W(xué)毒物經(jīng)過呼吸道、消化道及皮膚多種方式侵入機(jī)體,具有含量低、毒性高、病情發(fā)展快的特點(diǎn),易造成主要生理功能障礙,引發(fā)多器官衰竭甚至死亡。臨床化學(xué)中毒救治的首要前提是明確何種毒物中毒,以及中毒劑量、途徑等,因此,發(fā)展快速、準(zhǔn)確的臨床化學(xué)毒物檢測(cè)技術(shù)非常重要。干血斑(Dried Blood Spot,DBS)是一種先進(jìn)的血液采集及保存方式,僅需將指尖或足跟血滴在濾紙卡上,常溫下干燥2小時(shí)以上完成制備,具有操作簡(jiǎn)單、損傷小、便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存的優(yōu)勢(shì),目前在臨床快檢方面?zhèn)涫苤匾?便于與多種分析檢測(cè)技術(shù),如液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜、甚至常壓質(zhì)譜等結(jié)合,從而實(shí)施臨床中毒的快速檢測(cè)和持續(xù)監(jiān)測(cè)。其中,液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)可針對(duì)臨床化學(xué)毒物檢測(cè)濃度低、結(jié)構(gòu)相似物繁雜及性質(zhì)差異大等特點(diǎn),以其高靈敏度和高選擇性,為臨床中毒快速診斷和救治提供可靠、快速的定性定量依據(jù)。針對(duì)干血斑中的臨床化學(xué)毒物快速檢測(cè),如何實(shí)現(xiàn)普適、高效的樣品提取,便成為方法發(fā)展中的決定性要素。另外,近年來備受關(guān)注的常壓質(zhì)譜,是一種在敞開式大氣壓環(huán)境中便可實(shí)施的直接、快速檢測(cè)技術(shù),可實(shí)現(xiàn)通量式質(zhì)譜信息采集,以便滿足臨床多樣本快速檢測(cè)、診斷的需要。其中,低溫等離子體(Low Temperature Plasma,LTP)離子化技術(shù)的構(gòu)建較為簡(jiǎn)單、便捷,其等離子體溫度低、且無需噴霧溶劑,利于實(shí)現(xiàn)機(jī)體的無損分析。LTP質(zhì)譜和干血斑中的臨床化學(xué)毒物快檢是否能夠成功對(duì)接?其難點(diǎn)則在于如何增強(qiáng)離子化,以及選擇性地從復(fù)雜基質(zhì)中檢測(cè)出痕量分析物等方面。本研究針對(duì)臨床干血斑樣本,在重點(diǎn)考察濾紙卡種類、潤(rùn)濕步驟、提取溶劑種類基礎(chǔ)上,建立了以水潤(rùn)濕、甲醇提取等普適的前處理方法,以霉酚酸作為內(nèi)標(biāo),采用液相色譜-三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(LC-QqQ-MS/MS)實(shí)現(xiàn)了對(duì)12種香豆素類和茚二酮類抗凝血?dú)⑹笏幍亩ㄐ远糠治�。結(jié)果表明,在提取過程中加入適量的水潤(rùn)濕濾紙卡,有助于目標(biāo)化合物從纖維素鏈上游離出來并獲得較高的提取回收率。DMPK-A、-B、-C和903四種濾紙卡對(duì)于抗凝血鼠藥的干血斑分析存在差異,以903濾紙卡為基底時(shí),各鼠藥的提取率為66~115%,且結(jié)果穩(wěn)定(日內(nèi)RSD小于15%)。除殺鼠酮線性范圍為20~500 ng/mL(R~2=0.9987)外,其它11種鼠藥的線性范圍為5~500 ng/mL(R~2=0.9988~0.9996);12種鼠藥的回收率為61%~105%,基質(zhì)效應(yīng)在71%~193%(日內(nèi)小于15%)。該方法準(zhǔn)確、靈敏、快速且操作簡(jiǎn)便,已成功應(yīng)用于臨床實(shí)際中毒樣本的檢測(cè),滿足了臨床中毒快檢的需求,為抗凝血鼠藥中毒的診斷救治提供可靠的新技術(shù)方法。在上述研究基礎(chǔ)上,針對(duì)臨床常見毒物秋水仙堿,建立以903濾紙卡為基底,采用水潤(rùn)濕、0.1%甲酸-甲醇提取的快速前處理方法,與液態(tài)血漿的處理過程相比,具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、提取效率高的優(yōu)勢(shì)。以瑞芬太尼為內(nèi)標(biāo),采用LC-QqQ-MS/MS對(duì)秋水仙堿定性定量檢測(cè)。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,秋水仙堿的線性范圍為2~100 ng/mL(R~2=0.9991),回收率在100~115%,基質(zhì)效應(yīng)為108~153%(日內(nèi)小于15%),各項(xiàng)穩(wěn)定性考察均符合方法學(xué)要求,RSD15%。我們已將該方法成功應(yīng)用于臨床實(shí)際中毒樣本的檢測(cè),包括血漿、尿液、骨髓及透析液廢液。結(jié)果表明,干血漿斑與液態(tài)血漿的檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性,并且秋水仙堿在各生物樣本中的濃度與文獻(xiàn)報(bào)道的分布情況一致,為臨床秋水仙堿中毒的診斷提供可靠的新技術(shù)方法,指導(dǎo)臨床救治工作。為實(shí)現(xiàn)臨床干血斑樣本的直接、實(shí)時(shí)檢測(cè),針對(duì)具有精神活性的芬太尼類藥物,建立針對(duì)基于干血斑的低溫等離子體-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LTP-QTOF/MS)快速分析技術(shù),并對(duì)提高離子化效率和紙基底修飾方法進(jìn)行初步探究。先以咖啡因?yàn)槟Ｐ突衔?分別針對(duì)性優(yōu)化了LTP構(gòu)建參數(shù),確定的最優(yōu)條件為,以銅絲作為外加電極,電極間距為3.5 cm,電壓在2~2.5 kV,He氣流速為0.25 L/min及探針到質(zhì)譜進(jìn)樣口距離為2 cm。針對(duì)5種芬太尼類分析物,通過尖端套管對(duì)LTP探針進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,聚焦等離子體束,可以使芬太尼類化合物的信號(hào)增強(qiáng)2~3.5倍;另外,干血斑濾紙基底以含0.1%甲酸-甲醇浸潤(rùn)后可得到較佳的質(zhì)譜響應(yīng),以石墨涂覆輔助激光照射有助于增加基底導(dǎo)電、導(dǎo)熱性能,分析物信號(hào)提高1.4~2.2倍。分析物在解吸附后進(jìn)入Q-TOF-MS/MS質(zhì)譜分析器后,干燥氣流速為影響質(zhì)譜響應(yīng)的主要因素,毛細(xì)管電壓為800 V,干燥氣流速為8 L/min,噴霧器壓力為20 psig時(shí),芬太尼類化合物質(zhì)譜信號(hào)最高。目前5種芬太尼類化合物的LTP-QTOF/MS靈敏度為350 ng/mL,LTP-QTOF-MS/MS靈敏度略有提升,但仍比LC-QTOF MS/MS的靈敏度低1~2個(gè)數(shù)量級(jí)。預(yù)計(jì)下一步將從高功率激光輔助離子化、尾焰與源間距、尖端尾焰聚焦等多因素優(yōu)化出發(fā),及摻雜噴霧溶劑等提高離子化效率。
【圖文】：

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文紙卡（島津公司）則可在無需離心和低溫條件下，直接過濾為血漿。Henion 等[8]制備了一種折疊式血漿采集卡，無需離加到濾紙卡的全血溶液中分離出血漿。針對(duì)滴加在外層的血兩層商品化過濾膜有效去除紅細(xì)胞，并將血漿浸潤(rùn)至內(nèi)層濾可獲得干血漿斑樣品。該濾紙卡便于樣本的妥善保存，更易程。與商品化的血漿采集卡相比，其 HCT 適用范圍擴(kuò)大，0%的血液，從而在一定程度上克服了商品化濾紙卡 HCT 適）的問題。

圖 1.2 DESI 離子化示意圖，引自文獻(xiàn)[64]霧電離（PSI）基底的常壓離子化技術(shù)。噴霧溶劑滴加到濾紙上后通過高電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，一同遷移到達(dá)尖端發(fā)生電噴霧SI 相比，該技術(shù)無需氣體作為輔助，噴霧溶劑用量基底，裁剪成三角形，其尖端有助于電噴霧的發(fā)分析物在噴霧溶劑與濾紙相互作用下發(fā)生色譜分離、噴霧溶劑和質(zhì)譜參數(shù)，濾紙成為影響分析物離數(shù)，基于濾紙類型的考察和化學(xué)修飾的研究發(fā)展迅高疏水性，，將其制備成微球型，通過分散、聚合紙對(duì)樣品具有富集作用，減少溶液縱向滲透，提的檢測(cè)信號(hào)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R595;R446.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2701538