發(fā)布時(shí)間：2020-06-07 04:42

【摘要】：目的:細(xì)菌的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)能夠調(diào)控細(xì)菌的許多行為,如動(dòng)力、生物膜形成和毒力等。本研究前期通過對(duì)傷寒沙門菌(S.Typhi)進(jìn)行高通量測(cè)序轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)了許多非編碼RNA,其中在flhDC操縱子對(duì)側(cè)編碼的反義RNA引起了我們的注意,并將其命名為AsfD。本文旨在對(duì)AsfD進(jìn)行分子鑒定,并對(duì)其表達(dá)特性和功能開展深入研究。方法:1.AsfD的分子特征鑒定:在AsfD已知序列區(qū)設(shè)計(jì)兩條特異性探針引物,通過RT-PCR和Northern雜交驗(yàn)證AsfD在S.Typhi中的存在;然后運(yùn)用5’RACE和RT-PCR檢測(cè)AsfD的5’端和3’端,結(jié)合Northern雜交結(jié)果分析AsfD分子全長。2.AsfD表達(dá)特性分析:用Northern雜交和qRT-PCR檢測(cè)傷寒沙門菌不同生長時(shí)期AsfD的表達(dá);通過qRT-PCR分析傷寒沙門菌在不同應(yīng)激條件下(酸、氧、高滲)AsfD的表達(dá)特性。3.AsfD高表達(dá)菌株制備:根據(jù)Northern雜交,5’RACE和RT-PCR實(shí)驗(yàn)的鑒定結(jié)果,設(shè)計(jì)AsfD特異性引物,通過PCR擴(kuò)增AsfD目的片段。擴(kuò)增的片段包括了Nco I和EcoR I酶切位點(diǎn),并克隆到載體pBAD/HisA上。構(gòu)建相應(yīng)的高表達(dá)菌株(WT+pBAD-asfD)和對(duì)照株(WT+pBAD)。4.細(xì)菌動(dòng)力實(shí)驗(yàn):將S.Typhi的AsfD高表達(dá)菌株及空質(zhì)粒對(duì)照株接種于半固體培養(yǎng)基,過夜培養(yǎng),測(cè)S.Typhi在平板上的動(dòng)力圈直徑。5.細(xì)菌生物膜分析實(shí)驗(yàn):在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)AsfD高表達(dá)菌株及對(duì)照株至OD_(600)為0.4,并將菌液接種至96孔板中培養(yǎng)。96 h后用結(jié)晶紫染液對(duì)生物膜進(jìn)行染色,洗脫后檢測(cè)570 nm波長處吸光度值,分析生物膜形成量。6.細(xì)菌對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將AsfD高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期,然后加入培養(yǎng)有HeLa細(xì)胞的24孔板中與He La細(xì)胞共孵育,比較兩個(gè)菌株對(duì)于He La細(xì)胞侵襲能力的差異。7.qRT-PCR檢測(cè)靶基因flhDC及鞭毛基因mRNA:AsfD高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期,在0.2%(w/v)阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)30 min。通過TRIzol法提取RNA,用qRT-PCR分析AsfD對(duì)flhDC、fli A和fljB的表達(dá)水平影響。8.Western blot分析鞭毛蛋白FljB:將傷寒沙門菌AsfD高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期,在0.2%(w/v)阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)0、15、30和60 min。超聲破碎,離心取上清,使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AsfD高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對(duì)照株表達(dá)差異。結(jié)果:1.Northern雜交結(jié)果顯示,傷寒沙門菌中AsfD長約2300 nt;RACE實(shí)驗(yàn)表明AsfD 5’端位于flhC基因終止密碼子下游590 bp處;RT-PCR結(jié)果表明AsfD 3’端位于flhD基因起始密碼子上游558 bp~788 bp之間。2.Northern雜交和qRT-PCR結(jié)果顯示,AsfD的表達(dá)水平隨著傷寒沙門菌的生長而增高,并且在穩(wěn)態(tài)期達(dá)到最高水平;AsfD在酸、氧、高滲應(yīng)激后表達(dá)均明顯下降。3.成功構(gòu)建AsfD高表達(dá)菌株(WT+pBAD-asf D)和空質(zhì)粒對(duì)照株(WT+pBAD)。4.動(dòng)力實(shí)驗(yàn)顯示,與空質(zhì)粒對(duì)照株相比,AsfD高表達(dá)菌株動(dòng)力明顯增強(qiáng)。5.生物膜實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照株相比,AsfD高表達(dá)菌株生物膜形成能力增強(qiáng)。6.上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AsfD高表達(dá)菌株和對(duì)照株對(duì)He La細(xì)胞的侵襲能力無明顯變化。7.qRT-PCR結(jié)果顯示,與空質(zhì)粒對(duì)照株相比,AsfD高表達(dá)菌株能夠上調(diào)flhDC、fliA和fljB mRNA的表達(dá)。8.Western blot結(jié)果顯示,與空質(zhì)粒對(duì)照株相比,AsfD高表達(dá)菌株能夠上調(diào)鞭毛蛋白FljB的表達(dá)。結(jié)論:在S.Typhi中新鑒定了一個(gè)長鏈反義RNA AsfD,其分子全長在2079 nt~2310nt之間,AsfD確定的2079 nt序列能夠完全覆蓋flhDC操縱子;AsfD能增強(qiáng)傷寒沙門菌生物膜形成,并能通過直接上調(diào)靶基因flhDC的表達(dá),從而增強(qiáng)傷寒沙門菌動(dòng)力。
【圖文】：

20圖3.1 5'RACE原理圖Fig 3.1 5' RACE schematic3.2.2.2.3 5’ RACE實(shí)驗(yàn)（1） 提取傷寒沙門菌總RNA，，方法同前。（2）第一條cDNA鏈合成步驟 1 如下：組份 體積5X First-Strand Buffer 4.0 μlDTT (100 mM) 0.5 μldNTPs (20 mM） 1.0 μl總體積 5.5 μl

圖 4.2 檢測(cè)探針質(zhì)量Fig 4.2 The quality of pro 6000 Marker；1：RNA 樣本與特圖4.3 Northern印跡法檢測(cè)Fig 4.3 Detection of AsfD by No
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Ahmed Tawfik;Paul K Flanagan;Barry J Campbell;;Escherichia coli-host macrophage interactions in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年27期

本文編號(hào)：2700862