發(fā)布時間：2020-06-05 19:12

【摘要】：鑒于人體免疫系統(tǒng)的復雜性和動態(tài)性,當前癌癥早期篩查和臨床疾病診斷需要同時檢測多種疾病標志物�；诳贵w陣列的多組分化學發(fā)光免疫分析技術由于能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度、高通量、寬線性范圍、實時、原位及在體的檢測,日益受到人們的青睞。然而,當前化學發(fā)光多組分免疫分析法存在需要標記、分離及多次洗滌步驟,操作繁瑣,試劑消耗量大,耗時等問題。無標記免疫分析無需預先標記,也無需分離步驟,有效地避免了抗原或抗體因標記、分離及多次洗滌過程而導致活性降低等問題,具有試劑消耗量少,分析速度快,操作簡便等優(yōu)勢。相較于化學發(fā)光分析體系中常用的天然酶,有著過氧化物酶活性的納米材料具有優(yōu)良的催化活性,制備簡便,性質(zhì)穩(wěn)定,可調(diào)控性等優(yōu)勢。因此本論文提出了基于多種新型納米酶傳感陣列的無標記化學發(fā)光成像多組分免疫分析(CLI-MIA)新策略和新方法�；诩{米酶傳感陣列的CLI-MIA策略集成了納米酶的低成本、穩(wěn)定性和可調(diào)控性,化學發(fā)光測定的高靈敏度,免疫分析的高特異性以及抗體陣列基于的電感耦合CCD成像高檢測通量等優(yōu)勢。本論文合成了金屬氫氧化物納米籠、中空雙金屬納米球、多孔雙金屬核殼納米材料和金屬有機框架衍生物納米八面體材料,探究其過氧化物酶活性,并應用于構(gòu)建無標記化學發(fā)光成像多組分免疫傳感器陣列,實現(xiàn)了無標記、高通量、高靈敏、低消耗、可靠和快速的多腫瘤標志物檢測。具體研究工作如下:(1)本研究提出了基于3D Cu(OH)_2超籠納米酶的無標記化學發(fā)光成像多組分免疫分析新策略,旨在實現(xiàn)同時檢測多腫瘤標志物。通過低能耗的綠色合成程序,由1DCu(OH)_2納米帶自組裝形成的3D Cu(OH)_2超籠具有優(yōu)良的過氧化物酶活性。將分散在殼聚糖中的3D Cu(OH)_2超籠捕獲到環(huán)氧官能化微孔陣列中制成納米酶傳感界面。生物功能化復合物具有較大的反應表面積和優(yōu)異的生物相容性,因此基于鏈霉親和素對生物素化抗體的高度選擇性識別,從而使得多種抗體能夠被有效地固定在納米酶傳感陣列中。與相應的抗原在線溫育后,形成的免疫復合物會阻礙化學發(fā)光底物向3D Cu(OH)_2超籠納米酶傳感界面的擴散通道,最終導致CLI信號的降低。通過收集陣列中的每個傳感微孔的CLI信號,從而實現(xiàn)多組分定量檢測。以AFP,CEA,CA125為模型聯(lián)合標志物組,CLI免疫傳感陣列檢測的線性范圍分別為 0.0010-100 ng/mL(AFP),0.0010-75 ng/mL(CEA),0.0010-200 U/mL(CA125),檢測限低至 0.16pg/mL(AFP),0.20pg/mL(CEA),1.7×10~(-4)U/mL(CA 125)。本工作提出的基于3D Cu(OH)_2超籠納米酶的無標記CLI-MIA新策略,具有高通量、超靈敏、低消耗等優(yōu)勢,為癌癥大規(guī)模癌癥篩查與聯(lián)合準確診斷提供了新思路和新平臺。(2)本研究提出一種基于多孔PtAg雙金屬納米酶的化學發(fā)光成像多組分免疫分析新方法,用于在無標記的模式下同時檢測多種腫瘤標志物,具有優(yōu)良的靈敏度、超高的檢測通量及可接受的穩(wěn)定性。本工作制備的PtAg納米顆粒(PtAgNPs)為多孔核殼納米八面體結(jié)構(gòu),具有本征的過氧化物酶以及氧化酶雙功能酶活性,并且能夠維持長時間的催化活性。這種無標記多元測定可以通過簡單的策略輕松實現(xiàn)。首先將多孔PtAgNPs包埋于環(huán)氧硅烷化傳感陣列的微孔中制成納米酶傳感界面。然后用鏈霉親和素功能化PtAgNPs捕獲多組分生物素化抗體。當溫育上相對應的抗原后,所形成的免疫復合物會阻礙多孔PtAgNPs納米酶對化學發(fā)光底物的催化反應。通過電感耦合CCD照相機積分收集陣列中不同區(qū)域的化學發(fā)光亮度,從而實現(xiàn)了同時檢測CA 125,CEA和AFP。基于多孔PtAg雙金屬納米酶的無標記 CLI-MIA 方法在 0.0010-80 U/mL(CA 125)、0.0010-75 ng/mL(CEA)和0.0010-80ng/mL(AFP)的濃度范圍內(nèi)顯示出良好的線性,檢測限為1.3×10~(-4)U/mL(CA 125)、0.10 pg/mL(CEA)和0.13 pg/mL(AFP)。無標記CLI-MIA陣列具備良好的實際樣品的檢測能力,并表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性和特異性。(3)本研究提出了一種基于中空PdNi納米球(PdNi hNPs)的無標記化學發(fā)光發(fā)光成像多組分免疫分析(CLI-MIA)新方法,實現(xiàn)了對乳腺癌的聯(lián)合腫瘤標志物組的同時檢測。PdNi hNPs具有氧化酶和過氧化物酶的雙酶活性。利用PdNi hNPs的優(yōu)良過氧化物酶活性,將PdNi hNPs包埋于環(huán)氧基硅烷化微孔陣列中制成納米酶傳感陣列。然后通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)固定多種生物素化抗體,利用牛血清蛋白封閉未反應活性位點后,在相應位點溫育上多種抗原�？乖�-抗體復合物會阻礙PdNi hNPs納米酶對化學發(fā)光底物的催化作用,導致化學發(fā)光信號值下降。通過電感耦合CCD照相機積分收集不同區(qū)域的發(fā)光亮度,實現(xiàn)了對多腫瘤標志物的無標記、高通量、快速的檢測。從微孔區(qū)域積分收集的化學發(fā)光成像亮度值與腫瘤標志物濃度的對數(shù)值作圖,可得到對多種標志物檢測的工作曲線。基于 PdNi hNPs 納米酶傳感陣列的 CLI-MIA 策略在 0.0050-75 ng/mL,0.0010-100 U/mL和0.0010-240 U/mL范圍內(nèi)實現(xiàn)了對CEA,CA 125,CA 15-3同時檢測,并能成功應用于實際樣品檢測。本工作提出的無標記CLI-MIA可簡便地用于癌癥早期篩查與臨床診斷,具備很好的臨床應用潛力。(4)本研究以Cu-BTC為前驅(qū)體合成了 Cu/CuO/Cu_2O納米八面體金屬有機框架材料(MOFs)衍生物,首次探究發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)異的過氧化物酶活性,并應用于構(gòu)建化學發(fā)光成像多組分免疫分析新方法,實現(xiàn)對多腫瘤標志物的無標記、超靈敏、高通量檢測。基于納米酶的無標記多元測定可通過簡單的制作過程實現(xiàn)。首先,將殼聚糖分散的Cu/CuO/Cu_2O納米酶包埋于環(huán)氧基硅烷化微孔陣列中制成納米酶傳感陣列。然后通過鏈霉親和素將多種生物素化抗體專一性固定于微孔傳感陣列。當溫育相對應的抗原后,形成的抗體-抗原復合物會阻礙化學發(fā)光底物向Cu/CuO/Cu20納米酶傳感界面的擴散通道,最終導致CLI信號的減少。通過收集陣列中每個感應微孔的發(fā)光亮度,從而實現(xiàn)高通量、超靈敏、低消耗的多種疾病標志物的同時檢測。以CEA,CA 125,CA 19-9為模型聯(lián)合標志物組,該化學發(fā)光成像免疫傳感陣列的檢測線性范圍分別為0.0010-75 ng/mL(CEA)、0.0010-500 U/mL(CA 125)和 0.0010-240 U/mL(CA 19-9),檢測限低至 0.25 pg/mL(CEA)、2.0×10~(-4)U/mL(CA 125)和1.4×10~(-4) U/mL(CA 19-9)。該基于MOFs衍生物納米酶的無標記免疫傳感陣列可靠,靈敏,簡便,通量高,為發(fā)展多元生物傳感分析提供了新思路和新平臺。
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００逡逑ＩｇＧ逡逑圖１．１免疫球蛋白五大類別逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｆｉｖｅ邋ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ逡逑Ａｎｔ�。梗澹铄澹樱欤椋耍椋睿瑰澹樱椋簦澹箦澹邋澹捱姃M撕．？}0》ｗ；ｗ站ｔ邋0Ｇａｕ擺邐}0逡逑＇＇邋＇＂＾＊＊ＮＳＳＳＳ＾邐Ａｗ？邐Ａ．ｉｏ逡逑％ｖ－邋＾邋＾邋ｖ邋＋逡逑Ｔ邋＾邐－邐■邋ｍ邋ｍ逡逑＝二，知沈邐／、＃邋＼邋／邋＼逡逑ｉ！邋：邐Ｆ邋＿邋ｍ邐？珍銣逡逑，

本文編號：2698484