【摘要】：臨床血小板輸注主要用于防治因血小板減少或血小板功能障礙引起的出血或潛在的嚴(yán)重出血。冰凍血小板一般是指以二甲基亞砜(DMSO)為保護(hù)劑凍存于-65~-80℃的血小板,與22℃振蕩保存血小板相比,細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)小,保存期長(zhǎng)達(dá)2年以上,雖然輸入后不能有效提高血小板計(jì)數(shù),但具有與新鮮血小板相同的止血能力,適于失血引起凝血功能障礙的治療性輸注。特別是2005年之后,美軍醫(yī)學(xué)研究所、荷蘭軍方血站先后改進(jìn)了冰凍血小板的制備方法[1,2],采用O型血小板,加入DMSO后離心制成濃縮血小板約14ml,凍存于-80℃,輸注前融化,用AB型新鮮冰凍血漿重懸。該方法的優(yōu)點(diǎn)是(1)一個(gè)單位的冰凍血小板體積由原來(lái)的300ml濃縮至14ml左右,體積大為減小,便于儲(chǔ)備運(yùn)輸;(2)AB血漿重懸后不需洗滌和交叉配血,直接輸注給傷員,可實(shí)現(xiàn)快速施救。由此,該冰凍血小板(Cryopreserved platelets,CPPs)所具有的即刻止血效能和便于儲(chǔ)備運(yùn)輸?shù)那趧?wù)優(yōu)勢(shì)受到各國(guó)軍方的重視,荷蘭和比利時(shí)已將CPPs應(yīng)用于軍事行動(dòng)和武裝力量,美軍將CPPs列入戰(zhàn)時(shí)血液儲(chǔ)備計(jì)劃,并于2009年提交FDA審批,已完成I期臨床研究[3]。目前,CPPs雖然受到各國(guó)軍方關(guān)注,但尚未在任何國(guó)家通過(guò)審批成為正式的血液制品,安全性研究是延遲其臨床應(yīng)用的主要原因。血小板除了具有止血功能以外,還介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)[4,5],因此血小板輸注除了關(guān)注其止血效果,還需明確其可能帶來(lái)的不良反應(yīng)。近期在澳大利亞、捷克、美國(guó)已經(jīng)開展CPPs可行性和安全性的臨床試驗(yàn),但實(shí)驗(yàn)研究尚未完成,無(wú)明確結(jié)論[3]。本課題組前期采用小鼠失血模型,比較新鮮血小板、常溫儲(chǔ)存血小板和CPPs輸注對(duì)組織損傷的影響,發(fā)現(xiàn)CPPs組肝巨噬細(xì)胞(Kuffer cells,KCs)數(shù)量和炎性因子釋放顯著高于其他兩組[6]。在肝缺血再灌研究中,血小板輸注加重肝損傷主要與KC細(xì)胞相關(guān)[7]。由此,我們推測(cè)冰凍血小板與KC的相互作用是促進(jìn)肝損傷的重要環(huán)節(jié)。本研究即采用人單采去白血小板與佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)誘導(dǎo)的人單核巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞,體外研究CPPs對(duì)THP-1細(xì)胞的激活作用,探討其可能的作用機(jī)制。本研究分三部分,以22℃和4℃儲(chǔ)存血小板作為對(duì)照,研究-80℃保存血小板與THP-1相互作用的重要分子表達(dá),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供思路;明確-80℃血小板儲(chǔ)存的損傷特點(diǎn)。其次,以22℃和4℃儲(chǔ)存血小板作為對(duì)照,研究-80℃保存血小板與THP-1細(xì)胞的吞噬與活化作用;最后,封閉可能的重要分子,檢測(cè)THP-1細(xì)胞對(duì)CPPs的吞噬的影響,及CPPs與THP-1細(xì)胞共孵育后炎性因子釋放的影響,探討重要分子在介導(dǎo)CPPs與THP-1細(xì)胞活化中的作用第一章:不同儲(chǔ)存溫度對(duì)血小板損傷的比較研究目前研究認(rèn)為常溫(22℃)保存血小板輸注加重肝缺血再灌損傷,4℃保存血小板通過(guò)糖蛋白GPIbα的簇集,促進(jìn)與KC表面受體Mac-1的結(jié)合,導(dǎo)致被KC細(xì)胞快速清除。然而,針對(duì)-80℃保存血小板與KC細(xì)胞相互的作用研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以22℃和4℃血小板作為對(duì)照,探究-80℃保存血小板在儲(chǔ)存過(guò)程中血小板形態(tài)、表面活性分子的改變,炎性因子的釋放等,探討-80℃保存血小板的低溫?fù)p傷特點(diǎn),分析推測(cè)介導(dǎo)CPPs與THP-1相互作用的重要分子,同時(shí)為研究低溫血小板的損傷、凝血和體內(nèi)清除機(jī)制,及臨床血小板的選擇提供實(shí)驗(yàn)參考。研究方法:每單位單采去白血小板分為3份,分別于22℃振蕩保存,4℃靜置保存和依照荷蘭軍方冰凍血小板的制備方法-80℃凍存。于不同保存時(shí)間測(cè)定血小板平均體積(MPV),分布寬度(PDW);檢測(cè)試劑盒測(cè)定乳酸(Lac)和乳酸脫氫酶(LDH)含量;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面糖蛋白GPIbα表達(dá)與結(jié)構(gòu)變化,P-選擇素(P-selectin)和PS表達(dá);采用ELISA方法測(cè)定血漿中s CD40L和RANTES的含量。結(jié)果表明:4℃保存血小板隨保存時(shí)間延長(zhǎng),各指標(biāo)變化明顯,而-80℃凍存過(guò)程對(duì)各指標(biāo)的影響較大,在凍存1-28d內(nèi)變化不顯著。與22℃保存血小板相比,4℃保存血小板P-selectin、GPIbα末端N-乙酰基葡萄糖胺(β-Glc NAc)數(shù)量、PS陽(yáng)性率較高(P0.05),s CD40L表達(dá)低(7d)(P0.05,);MPV和LDH值略高、Lac值略低,但差異不顯著。與4℃和22℃保存的相比,-80℃保存顯著增加血小板MPV、LDH值和PS表達(dá)陽(yáng)性率(P0.05),顯著降低GPIbα表達(dá)和Lac含量(P0.05);-80℃保存血小板P-selectin表達(dá)高于保存1d、低于保存7d的22℃保存血小板(P0.05),低于保存3d的4℃保存血小板(P0.05);-80℃保存血小板s CD40L和RANTES含量低于4℃保存10d的血小板(P0.05)。小結(jié):與22℃血小板相比,4℃保存不加重血小板膜損傷,但促進(jìn)血小板活化與凋亡;-80℃保存嚴(yán)重?fù)p傷血小板膜,顯著降低血小板GPIbα表達(dá),促進(jìn)PS和P-selectin表達(dá),抑制代謝與炎性因子釋放;-80℃保存血小板s CD40L和RANTES釋放、GPIbα表達(dá)顯著低于4℃保存血小板,而PS的表達(dá)則顯著高于4℃保存血小板,提示兩者對(duì)KC細(xì)胞的作用方式不同,推測(cè)冰凍血小板表達(dá)的PS和P-selectin可能是介導(dǎo)血小板與KC相互作用的主要分子。第二章:冰凍血小板對(duì)THP-1的活化作用在前期研究工作中,我們給重度失血小鼠輸注新鮮、常溫儲(chǔ)存和CPPs,發(fā)現(xiàn)CPPs輸注加重肝損傷,肝臟巨噬細(xì)胞數(shù)量和炎性因子釋放顯著高于新鮮和常溫儲(chǔ)存血小板輸注。為了進(jìn)一步明確CPPs與巨噬細(xì)胞的相互作用,本研究采用PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞,體外檢測(cè)人單采去白血小板冰凍保存后與THP-1細(xì)胞的吞噬與活化作用。研究方法:采用PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)分析,吞噬能力檢測(cè)和表面標(biāo)志CD11b和CD14的表達(dá),確定PMA的誘導(dǎo)條件;采用不同濃度的LPS預(yù)活化THP-1細(xì)胞,與CPPs共孵育后檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)表達(dá),以無(wú)血小板與THP-1共孵育作為對(duì)照,確定合適的LPS預(yù)活化條件;將不同溫度儲(chǔ)存3d的三種血小板(22℃,4℃,-80℃)與THP-1細(xì)胞共孵育,通過(guò)熒光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬,ELISA方法檢測(cè)血小板與THP-1細(xì)胞共孵育后TNF-α、IL-6、IL-1β和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)。結(jié)果表明:THP-1的誘導(dǎo)條件為:25ng/ml PMA誘導(dǎo)24h,無(wú)PMA繼續(xù)培養(yǎng)48h。該條件下,THP-1貼壁牢固,部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,伸出偽足。吞噬能力較強(qiáng)為80%,CD11b和CD14表達(dá)陽(yáng)性率均接近100%,表達(dá)量較高;隨著LPS濃度的增高,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)TNF-α、IL-6和IL-1β均逐漸增加。當(dāng)以0.5ng/ml的LPS的刺激THP-1細(xì)胞3h時(shí),實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)顯著高于對(duì)照組,且兩組炎性因子濃度差值較大;THP-1細(xì)胞對(duì)-80℃保存血小板的粘附與吞噬率顯著高于22℃和4℃保存血小板(P0.05);-80℃保存血小板與THP-1共孵育后炎性因子TNF-α,IL-1,IL-6和TGF-β的表達(dá)顯著高于22℃和4℃保存血小板(P0.05);血小板與THP-1細(xì)胞共孵育表達(dá)的TNF-α,IL-1,IL-6和TGF-β水平,LPS預(yù)活化組顯著高于無(wú)LPS預(yù)活化組(P0.05)。小結(jié):確定THP-1細(xì)胞的誘導(dǎo)條件;在優(yōu)化的LPS預(yù)活化條件下,THP-1細(xì)胞即被輕度活化,又不會(huì)掩蓋血小板對(duì)THP-1細(xì)胞的激活作用;證實(shí)與22℃和4℃保存血小板相比,-80℃保存血小板更易被THP-1細(xì)胞吞噬,同時(shí)促進(jìn)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的炎性因子;LPS預(yù)活化THP-1細(xì)胞促進(jìn)了血小板對(duì)THP-1細(xì)胞的活化作用。第三章:冰凍血小板促進(jìn)THP-1細(xì)胞活化的機(jī)制根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè)CPPs表面PS和P-selectin表達(dá)的增加是介導(dǎo)血小板被THP-1細(xì)胞吞噬,及促進(jìn)THP-1活化的重要途徑。本研究采用Annexin-V和P-selectin抗體(Anti-P-selectin)來(lái)封閉血小板表面的PS和P-selectin,檢測(cè)THP-1細(xì)胞對(duì)CPPs的吞噬的影響,及CPPs與THP-1細(xì)胞共孵育后炎性因子釋放的影響,探討血小板表面PS和P-selectin在介導(dǎo)CPPs與THP-1細(xì)胞活化中的作用。研究方法:分別采用0、0.5、1、2、4、8、16μg/ml的Annexin-V和Anti-P-selectin加入冰凍血小板中預(yù)封閉血小板表面PS和P-selectin,隨后與THP-1細(xì)胞共孵育,采用熒光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬情況,ELISA方法檢測(cè)CPPs與THP-1細(xì)胞共孵育后TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β的表達(dá)。結(jié)果表明:隨著Annexin-V和Anti-P-selectin濃度的增高,THP-1細(xì)胞對(duì)CPPs的吞噬逐漸降低,抑制率分別可達(dá)60%和20%;2μg/ml的Annexin-V或4μg/ml的Anti-P-selectin可以抑制冰凍血小板與THP-1細(xì)胞共孵育后促炎因子TNF-α,IL-1β,IL-6的表達(dá),并促進(jìn)抑炎因子TGF-β的表達(dá)。對(duì)比Annexin-V和Anti-P-selectin的作用效果,2μg/ml Annexin-V的抑制效果更顯著。小結(jié):初步證實(shí)CPPs表面PS外翻和P-selectin高表達(dá)是介導(dǎo)血小板被THP-1細(xì)胞吞噬,及促進(jìn)THP-1炎性因子釋放的重要分子。通過(guò)以上研究,我們首次證實(shí)了與22℃和4℃保存血小板相比,CPPs表面更易被巨噬細(xì)胞吞噬;與4℃保存血小板通過(guò)GPIbα高表達(dá)與簇集介導(dǎo)血小板被巨噬細(xì)胞吞噬不同,CPPs表面PS大量外翻和P-selectin高表達(dá)是血小板被巨噬細(xì)胞吞噬的主要原因;與22℃和4℃保存血小板相比,CPPs促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放更多的炎性因子;巨噬細(xì)胞對(duì)CPPs的大量吞噬促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化,血小板表面大量PS外翻在此過(guò)程中發(fā)揮更加重要的作用。通過(guò)本研究,我們初步證實(shí)了血小板冰凍保存后,增強(qiáng)了與巨噬細(xì)胞的吞噬與活化作用,從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),加重炎性損傷。提示在失血造成一次打擊的情況下,輸注CPPs后,需要關(guān)注肝臟不良反應(yīng)的發(fā)生。
【圖文】：

1.3.1 血小板樣本依照臨床單采血小板的采集標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采集，初檢質(zhì)量合格，每人份血小板計(jì)數(shù)可達(dá)為 700-800×109/L。1.3.2 血小板儲(chǔ)存過(guò)程中 MPV 和 PDW 的改變與 22℃常規(guī)儲(chǔ)存血小板相比，4℃和-80℃血小板隨時(shí)間變化其 MPV 變化情況見(jiàn)圖 1.1A，PDW 變化情況見(jiàn)圖 1.1B。變化指數(shù)各檢測(cè)點(diǎn) MPV 和 PDW 與 22℃血小板的比值。由圖 1.1A 可知，22℃保存血小板在保存期內(nèi)（1-7d）MPV 隨時(shí)間變化逐漸升高，，但在 7d 之后顯著升高；與 22℃血小板相比，4℃保存血小板在保存 1-7d 其 MPV 值也逐漸升高，且略高于 22℃保存的血小板；從儲(chǔ)存第 1d的測(cè)定值來(lái)看，4℃和-80℃血小板均高于 22℃血小板，且保存 1-28d 的-80℃血小板組 MPV 值顯著高于保存 1-7d 的 22℃血小板；在保存第 21d 時(shí)，4℃血小板MPV 值顯著高于-80℃保存的血小板；血小板凍融過(guò)程顯著增加 MPV 值，但 MPV值受保存時(shí)間的影響不大。由圖 1.1B 可見(jiàn)，-80℃保存 28d 以內(nèi)與 22℃保存 1-7d的 PDW 相比無(wú)顯著改變；4℃保存 10d 之后 PDW 明顯增加。

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文1.3.3 血小板儲(chǔ)存過(guò)程中 LDH 和 Lac 的改變?nèi)N不同儲(chǔ)存方式血小板在儲(chǔ)存過(guò)程中 LDH 變化情況見(jiàn)圖 1.2A，Lac 變化情況見(jiàn)圖 1.2B。由圖 1.2A 可見(jiàn)，22℃血小板與 4℃保存的血小板類似，隨保存時(shí)間延長(zhǎng) LDH產(chǎn)生增多，變化趨勢(shì)無(wú)顯著區(qū)別；-80℃凍融處理（保存 1d）后 LDH 較 4℃和22℃血小板顯著增加，為 0d 新鮮血小板的 2-3 倍，但隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)（1-28d）LDH 無(wú)顯著變化。由圖 1.2B 可知，與 22℃血小板類似，4℃保存的血小板隨保存時(shí)間延長(zhǎng) Lac 產(chǎn)生增多，兩者無(wú)顯著差別；-80℃保存 1-28d 內(nèi) Lac 濃度顯著低于 22℃和 4℃保存的血小板，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨時(shí)間延長(zhǎng)其 Lac 濃度無(wú)明顯改變。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R457.1

【參考文獻(xiàn)】

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2 謝玉英;;談活性氧與人類疾病[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2009年15期

3 歐陽(yáng)錫林,劉景漢,韓瑋,王海寶,高大勇;冰凍保存血小板新亞群及其膜表面分子分析[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2003年02期

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