【摘要】：目的:本研究旨在通過生物礦化法制備一類以不同蛋白為模板的新型氧化釓納米顆粒,以獲得顯著T_1WI磁共振增強效果、優(yōu)異的腫瘤靶向性以及良好的生物兼容性。首先,擬通過模擬臨床常規(guī)增強磁共振血管造影方法和劑量,探索基于近年來研究較為集中的牛血清白蛋白的氧化釓納米顆粒(GdNPs-BSA)在中型動物模型(家兔)的磁共振血管造影成像效果,深入探討該探針在較大動物體內(nèi)的生物代謝特點、生理變化和Gd元素的體內(nèi)殘留量,進一步評價其臨床轉(zhuǎn)化前景;同時,本研究結(jié)合最新納米技術(shù),通過在國內(nèi)外首次利用生物礦化法制備了基于人源轉(zhuǎn)鐵蛋白為模板的新型磁共振納米探針(Gd@TfNPs),通過對前列腺癌荷瘤鼠模型的磁共振系列成像研究,明確該探針的高弛豫率、主動腫瘤靶向和生物可代謝等優(yōu)異特點,進而有望通過本研究開發(fā)出一種更具臨床轉(zhuǎn)化前景的新型人源蛋白基磁共振T1增強造影劑方法:1.蛋白基新型磁共振納米顆粒的制備。通過模擬生物礦化法制備基于牛血清蛋白的氧化釓納米顆粒,并對其進行表征,包括利用高清晰度透射電鏡、粒度分析儀對其形貌進行觀察,利用紫外-可見分光光度計明確蛋白理化結(jié)構(gòu)的變化,通過磁共振成像設備了解其磁共振顯影性能;利用同樣方法嘗試制備基于人源轉(zhuǎn)鐵蛋白的氧化釓納米顆粒并對其進行表征。2.進一步明確以模擬生物礦化法合成的基于牛血清蛋白的氧化釓納米顆粒(GdNPs-BSA)在中型動物(家兔)體內(nèi)的磁共振血管造影顯像效能及生物相容性研究。選取4-6只家兔隨機分為對照組及實驗組,分別以高壓靜脈注射的方式給予等量的釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)及GdNPs-BSA,觀察兩組家兔的背大動脈、腎動脈等大血管的顯影情況,觀察兩組家兔分支血管的顯影情況,通過病理學檢查明確兩種造影劑對主要組織臟器的影響,通過對血液生化指標的動態(tài)監(jiān)測明確其對重要臟器功能的影響。3.明確以模擬生物礦化法合成的Gd@Tf NPs的腫瘤靶向成像能力及生物相容性。通過對Gd@Tf NPs弛豫率測定及磁共振顯像實驗了解其磁共振顯影能力;通過細胞競爭抑制實驗明確Gd@Tf NPs的體外靶向能力;通過構(gòu)建TfR陽性的前列腺癌PC-3細胞的裸鼠模型,明確Gd@Tf NPs對于TfR陽性的前列腺癌腫瘤靶向顯影效能;通過對鼠尾靜脈注射Gd@Tf NPs小鼠的連續(xù)2周MR掃描,記錄各組織器官的磁共振信號強度變化,判斷Gd@Tf NPs在小鼠體內(nèi)可能代謝途徑;通過體外MTT實驗及小鼠組織病理學檢查,明確Gd@Tf NPs的體內(nèi)體外毒性;通過檢測小鼠2周的血液學指標及體重的動態(tài)變化,明確Gd@Tf NPs對小鼠生存狀態(tài)的影響。結(jié)果:1.蛋白基新型磁共振納米顆粒的制備。通過生物礦化法成功制備GdNPs-BSA及Gd@Tf NPs,通過高分辨力透射電鏡看到兩種納米顆粒具有很好的分散性,呈小顆粒狀,經(jīng)粒徑分析得出兩種材料粒徑均小于5nm,符合納米材料的尺寸要求;通過紫外-可見分光光度計測得280nm處蛋白的特異吸收峰,說明經(jīng)生物礦化法值得的氧化釓納米顆粒保留了蛋白的固有性狀,通過ICP-MS及弛豫率結(jié)果證明本課題組所合成的新型氧化釓納米顆粒具有比傳統(tǒng)釓噴酸葡胺(Magnevist?)更高的弛豫率(約4-5倍)。2.GdNPs-BSA的CE-MRA顯影效能及生物相容性研究。通過高壓注射等量Magnevist?及GdNPs-BSA于家兔體內(nèi),結(jié)果顯示注射GdNPs-BSA后較Magnevist?具有更優(yōu)異的血管顯影效能。GdNPs-BSA具有對家兔背大動脈、鎖骨下動脈、腎動脈等更好的顯示能力,并且可清楚顯示主動脈、腎動脈及髂動脈的分支血管,獲得的圖像清晰,與周圍組織可形成鮮明對比。通過病理學觀察顯示,家兔各主要臟器內(nèi)未見明顯Gd離子沉積及明顯細胞水平形態(tài)學變化,2周血液生化學指標監(jiān)測顯示,家兔注射GdNps-BSA前后重要臟器功能血液生化學數(shù)值未見明顯統(tǒng)計學差異。3.Gd@Tf NPs的MRI成像效能及生物相容性研究。通過細胞及小鼠磁共振成像結(jié)果顯示該納米顆粒具有良好的磁共振顯影效能。細胞競爭抑制試驗表明了Gd@Tf NPs的體外靶向能力。通過構(gòu)建的TfR陽性的前列腺癌小鼠模型,注射少量Gd@Tf NPs溶液后采集磁共振圖像結(jié)果證明了Gd@Tf NPs出色的腫瘤靶向成像效果。經(jīng)MTT實驗證實了Gd@Tf NPs的體外低毒性,2周小鼠病理學檢查未顯示出Gd在重要臟器內(nèi)的沉積,表明其體內(nèi)的低毒性。分時連續(xù)觀察注射Gd@Tf NPs后小鼠各重要臟器的磁共振信號強度變化特點,結(jié)合排泄物測定結(jié)果得出,Gd@Tf NPs大部分經(jīng)肝臟攝取后經(jīng)腸道隨糞便排出。通過2周血液學指標的觀察及體重的測量,注射Gd@Tf NPs后的小鼠各項數(shù)據(jù)基本平穩(wěn),說明Gd@Tf NPs對小鼠生存狀態(tài)無明顯影響。結(jié)論:1.以生物礦化法制備蛋白基納米顆粒具有較強的可操作性及可重復性,并且其反應條件溫和,最大程度保留了蛋白及金屬元素的理化性質(zhì),是一種應用性極強并極具開發(fā)潛力的納米材料合成方案。2.基于BSA的氧化釓納米顆�？沙晒νㄟ^臨床血管造影方式在中型動物體內(nèi)完成血管造影成像并獲得良好成像效果。GdNPs-BSA有效減低了臨床血管造影操作檢查難度,不僅具有良好的大血管及分支血管顯影效能,并且低毒,具有良好的生物相容性,可作為優(yōu)選臨床磁共振血管造影劑開展進一步臨床轉(zhuǎn)化研究。3.成功的合成了基于人源Tf的氧化釓納米顆粒,通過各項體內(nèi)體外實驗證明,該納米材料不僅顯著提高了釓的弛豫率,并且成功保留了Tf的生物學功能,能有效靶向TfR高表達的腫瘤細胞及病變組織。同時,經(jīng)證實,首次合成的Gd@Tf NPs不僅具有更高的穩(wěn)定性,更低的毒性,并且可被肝臟特異性攝取,經(jīng)腸道隨糞便排出。因此,以模擬生物礦化法制備的基于人源轉(zhuǎn)鐵蛋白的新型氧化釓納米顆粒不僅具有優(yōu)異的腫瘤特異顯像效果,并且是一種低毒、具有高度生物相容性及廓清率的新型納米材料。綜上所述,通過模擬生物礦化法制備的基于蛋白的氧化釓納米顆粒是一類合成方法簡單、具有高弛豫率、高生物相容性及廓清率的新型納米材料,具有優(yōu)異的磁共振顯影效能,具有極大的臨床轉(zhuǎn)化價值及應用潛力。
【圖文】：

出非常顯著的 T1WI 強化效果[5]。陰性造影劑主要作用為縮短橫向弛豫時間（t2），在磁共振 T2WI 圖像上病變部分呈明顯低信號改變，亦稱 t2造影劑，以鐵元素為主的超順磁性物質(zhì)為代表。迄今為止，在臨床應用最為廣泛的仍是釓類造影劑。至本文成稿前，獲得美國 FDA 批準可用于臨床使用的釓類造影劑主要有（1）釓噴酸葡胺（Gd-DTPA，商品名 Magnevist ）（2）釓雙胺（Gd-DTPA-BMA 商品名 Omniscan ）（3）釓弗塞胺（Gd-DTPA-BMEA 商品名 OptiMARK ）（4）釓貝葡胺（Gd-BOTPA 商品名 MultiHance ）（5）釓特酸葡胺（Gd-DOTA 商品名 Dotarem ）（6）釓特醇（Gd-HP-DO3A 商品名 ProHance ）（7）釓布醇（Gd-DO3A-butrol 商品名 Gadovist ）（化學結(jié)構(gòu)式見圖 1）。

電感耦合等離子體發(fā)射光譜-icp-oes7000 series 中國 ThermoXRD 測試儀 TIGAKU/MAX2500V/PC日本理學公司納米粒度及 zeta 電位儀 Nano ZS 英國 馬爾文 1.1.2 GdNPs-BSA 的合成GdNPs-BSA 合成步驟完全按照文獻報道[73]進行，反應過程見圖 1.1，具體方法如下：稱取 1ml 50mM Gd（NO3）3 6H2O 和 250mg 的 BSA，將 BSA 加入到 9ml高純水，將兩種溶液在 37℃下攪拌 5 分鐘，，此時溶液成白色渾濁狀。將 NaOH（1M，1ml）逐滴加入到混合物中，溶液逐漸變清澈。將反應溶液在 37℃下攪拌 12 小時。所得的混合溶液用 PBS 洗滌三次，10000rpm 離心 30 分鐘，吸取透明上清液。使用超濾離心管以 5000rpm 進行超濾 45 分鐘。以上步驟重復 3 次，得到純化的 GdNPs-BSA。制備好的溶液 4℃保存。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R445.2

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5 洪在地;

本文編號：2684949