【摘要】：目的:在人體中,更新快速的小腸組織細胞和造血干細胞對電離輻射(Irradiation,IR)最為敏感,而與造血系統(tǒng)相比,電離輻射誘發(fā)的小腸結構與功能紊亂發(fā)生機制研究不夠深入,缺乏有效的防治手段。因此,尋找低毒、高效、方便服用的腸道電離輻射損傷防治藥物及闡明其相關機理一直是放射生物學領域熱門話題之一。本課題組前期工作篩選了多種香蘭素衍生物的電離輻射防護作用,發(fā)現(xiàn)丁香醛(VND3207)顯著提高細胞電離輻射抗性、抑制細胞凋亡。本論文主要從VND3207對放射性腸損傷的防護效果和防護機制展開討論。方法:(1)9 Gyγ射線全身照射6-8周齡C57BL/6J小鼠,照前0.5小時灌胃給予VND3207(100 mg/Kg)或溶劑對照,照射后記錄小鼠的生存狀態(tài),繪制生存和體重曲線;并在不同時間點取腸道制備病理學切片,通過HE染色觀察VND3207對小鼠腸道病理形態(tài)學的影響,同時,應用TUNEL凋亡檢測試劑盒和cleaved caspase-3免疫組化染色檢測小鼠腸道隱窩細胞凋亡的情況,并用Ki67的免疫組化染色觀察小鼠隱窩的增殖情況。另外,使用人源的腸上皮細胞(HIEC-6)做體外實驗的驗證,CCK-8實驗檢測不同濃度的VND3207對HIEC-6細胞毒性;應用EDU試劑盒檢測VND3207對受照后細胞的增殖影響;明確VND3207對放射性腸損傷的防護效果。(2)應用基因表達譜芯片篩選單純照射組和VND3207聯(lián)合照射組之間的差異表達基因,q RT-PCR對其中的一些差異表達基因Slc5a4a、Akr1c14、Maob、Nfkbia、Gadd45g和Pmaip1進行了驗證。篩選出VND3207靶向基因及其所在區(qū)域,對其進行簡要地分析,并使用免疫組化的方法探索VND3207對輻照后的小鼠腸道組織中Noxa相關信號分子的表達影響。(3)VND3207預處理C57BL/6J小鼠半個小時后,給予9 Gyγ射線進行全身照射,并在照后不同時間點取小腸組織,檢測照后3.5 d和7 d的小腸組織中的氧化應激水平。并通過8-OHdG和γ-H2AX的組織免疫熒光染色觀察小腸隱窩細胞DNA的氧化損傷和雙鏈斷裂損傷;同時,在細胞水平上采用γ-H2AX的免疫熒光檢測DNA的損傷修復;Western blot檢測VND3207對腸上皮細胞中的DNA-PKcs自磷酸化的影響;探討在腸道組織和細胞中,VND3207調控輻射誘發(fā)的DNA損傷及功能分子的修復機制。結果:(1)與單純照射組相比,VND3207顯著的改善小鼠的體重并明顯延長9Gyγ射線照射的C57BL/6J小鼠的存活時間,顯著提高其存活率,有效保護電離輻射引起的腸組織結構損傷,在降低小腸隱窩細胞凋亡率的同時促進腸隱窩細胞的增殖。(2)小鼠腸道組織基因芯片分析發(fā)現(xiàn)VND3207可顯著調控多種基因的表達及信號通路,進而免疫組化分析結果顯示VND3207通過調控小鼠腸道組織中p53蛋白的磷酸化修飾,進而抑制Noxa蛋白表達,并緩解了輻射引起的凋亡。GO富集分析表明了VND3207參與維持腸道微生物的穩(wěn)態(tài),初步闡述VND3207對放射性腸損傷的防護機制。(3)通過檢測小鼠腸道組織的抗氧化活性和DNA損傷指標揭示了VND3207可以降低腸道中的氧化應激水平,緩解輻射誘發(fā)的DNA氧化損傷和DNA雙鏈斷裂損傷,在細胞水平上,同樣應用免疫熒光染色標記γ-H2AX和Western blot分析DNA-PKcs的自磷酸化水平,分析結果顯示,VND3207顯著抑制γ-H2AX的形成,以及促進DNA損傷修復關鍵分子DNA-PKcs的自磷酸化。表明VND3207可能參與DNA的NHEJ修復,對輻照后小鼠腸道組織的重建過程做出重要的貢獻。結論:本研究證實VND3207對放射性腸損傷的保護作用,緩解放射性腸損傷癥狀,揭示了VND3207對放射性腸損傷的防護機制可能有三個方面:一是參與調控小鼠腸道組織中p53磷酸化激活,抑制Noxa誘導的細胞凋亡;二是降低輻射引起的氧化應激水平,從而抑制小鼠腸道組織的DNA氧化損傷和雙鏈斷裂損傷;三是可能通過參與調控DNA-PKcs的自磷酸化,促進受輻照損傷DNA的NHEJ修復。本研究為揭示放射性腸損傷發(fā)生、發(fā)展機制提供新的理論與實驗依據(jù)。
【圖文】：

第一部分 VND3207 對小鼠放射性腸損傷的防護作用及其機制研究分析結果顯示，如圖 1.1A 單純照射組的小鼠在第四天就開始逐漸死亡，至第13 天全部死亡，而 VND3207 聯(lián)合照射組的小鼠至第 10 天才開始出現(xiàn)死亡，觀察至第 30 天時仍有 40% 的小鼠存活，且數(shù)據(jù)分析結果具有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.001）由此說明 VND3207 聯(lián)合照射組與單純照射組小鼠相比存活時間顯著延長；雖然在照射后初期各組小鼠的體重都相對減輕，但單純照射組小鼠的體重降低的較快，而 VND3207 聯(lián)合照射組小鼠體重在照后 15 天達到最低，隨后存活的小鼠體重開始逐漸的恢復（圖 1.1 B）。這表明 VND3207 可以改善照后小鼠的生活狀態(tài)和體重變化。

圖 1.2-1 VND3207 對輻照后小鼠腸道形態(tài)結構的影響A. C57BL/6 小鼠被給予 9 Gyγ 射線的全身照射，照后 3.5 d 小腸組織形態(tài)結構圖；B. 小鼠絨毛長度和隱窩深度定量分析（**p < 0.01, ***p < 0.01, n = 6）。隱窩數(shù)目和深淺的變化與隱窩細胞的增殖情況密切相關，據(jù)研究表明，在小鼠腸道受照射后的 3.5 d，隱窩細胞增殖最為明顯，為此我們采用免疫組化染色分析 3.5 d 取樣的腸道組織中 Ki67 的表達情況，Ki67 標記的是處于增殖周期中的細胞，該標記陽性率越高，組織的增殖速度越快[5]。如圖 1.2-2 C，γ 射線照射前，對照組和 VND3207 組小鼠腸道隱窩處的 Ki67+細胞數(shù)無明顯差異。而照射后，單純照射組中的 Ki67+細胞數(shù)明顯減少，VND3207 聯(lián)合照射組中處于細胞周期所有活躍期的細胞數(shù)目顯著增多。通過對小鼠腸道橫切面每周的陽性隱窩數(shù)和 Ki67+細胞數(shù)進行計數(shù)統(tǒng)計分析(圖 1.2-2 D 和 E)，發(fā)現(xiàn) VND3207 聯(lián)合照射組中陽性隱窩數(shù)增至 105±9（單純照射組 61±4），Ki67+細胞數(shù)增至 30±1（單純照射組 16±1），兩者差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。由此結果說明，，VND3207 可以促進小鼠
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.55

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本文編號：2677010