【摘要】：膿毒癥(sepsis)是指機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙。盡管膿毒癥真實(shí)的發(fā)病率仍然是未知數(shù),保守的估計(jì)表明膿毒癥是全球范圍內(nèi)患者死亡和危重疾病的一個(gè)主要病因。膿毒癥治療的花費(fèi)巨大,2011年來(lái)自美國(guó)的數(shù)據(jù)表明,超過(guò)200億美元(美國(guó)醫(yī)院臨床費(fèi)用的5.2%)。急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是膿毒癥發(fā)展過(guò)程中最常見的并發(fā)癥之一。AKI的發(fā)病率會(huì)隨膿毒癥的嚴(yán)重程度而增加,患者出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷(sepsis associated acute kidney injury,SA-AKI)時(shí)病死率翻倍,明顯高于其他因素導(dǎo)致的AKI。SA-AKI以急性腎衰竭為特征,表現(xiàn)為血液過(guò)濾不充分,水、電解質(zhì)調(diào)節(jié)及尿液產(chǎn)生障礙。由于SA-AKI發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前臨床對(duì)SA-AKI患者以對(duì)癥支持治療為主,因此探明SA-AKI的發(fā)病機(jī)制并以此為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。HMGB1是一種進(jìn)化高度保守且廣泛存在的蛋白,其通常作為染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白而與DNA相結(jié)合。在大多數(shù)類型的細(xì)胞中,HMGB1主要存在于細(xì)胞核內(nèi)參與維持核小體的形態(tài)和DNA的復(fù)制。在細(xì)胞質(zhì)中的HMGB1則作為一種DAMP 分子通過(guò)和 TLR2(Toll like receptor-2)、TLR4、RAGE 和 CXCR4(chemokine receptor 4)等的相互作用激活促炎信號(hào)通路。因此,細(xì)胞受到炎癥打擊時(shí)可使HMGB從胞核移位到胞漿并發(fā)揮抗炎作用。有研究表明乙酰化修飾促進(jìn)了 HMGB1的核漿移位,并最終促進(jìn)了 HMGB1的細(xì)胞外分布。提示通過(guò)對(duì)HMGB1的去乙酰化修飾可抑制它介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然而,HMGB1的去乙酰化修飾上游機(jī)制尚不明確且HMGB1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否參與了膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展尚未見報(bào)道。腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)是腎小管的主要細(xì)胞,它參與了腎小管的重吸收、分泌和排泄等功能。缺血、感染和毒物等刺激引起RTEC損傷是腎小管功能障礙的主要因素,它們加速了 AKI的發(fā)展。然而,RTEC在SA-AKI的具體發(fā)生機(jī)制尚不明確。己知沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(Sirtuins)是一類進(jìn)化中高度保守的蛋白,由SIR基因編碼,屬于Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶。SIRT1是酵母Sir2的哺乳動(dòng)物直接同源體之一,是目前研究的最多的哺乳動(dòng)物sirtuin家族成員。SIRT1在胚胎發(fā)育和骨骼肌的分化過(guò)程中扮演很重要的作用。根據(jù)具體的環(huán)境不同,SIRT1在細(xì)胞中扮演不同的作用。目前研究表明,SIRT1主要通過(guò)去乙酰化修飾某些組蛋白和非組蛋白發(fā)揮作用。目前研究證實(shí)的SIRT1的非組蛋白底物有P53、NF-1κB、PGC-lα、FOXO、liver X receptor(LXR)、PARP、Ku70、HIF-la等。我們最近研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥后,小鼠腎臟組織和腎小管上皮細(xì)胞的SIRT1蛋白表達(dá)和活性下降加重SA-AKI,而SIRT1激活可以減輕SA-AKI。最近的研究也發(fā)現(xiàn)HMGB1也是SIRT1去乙�；饔酶锇械鞍�,且SIRT1能夠去乙酰化HMGB1提高內(nèi)毒素小鼠的生存率。這些結(jié)果提示SIRT1減輕SA-AKI的機(jī)制可能和SIRT1去乙酰化HMGB1有關(guān)。通過(guò)上述文獻(xiàn)的回顧,我們推測(cè)膿毒癥打擊導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的SIRT1蛋白表達(dá)和活性下降,HMGB1的核漿移位增加,HMGB1釋放到胞質(zhì)增加,加重了膿毒癥后系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。因此,我們擬構(gòu)建SA-AKI相關(guān)的動(dòng)物和細(xì)胞模型:1、觀察各處理組HMGB1的蛋白表達(dá)及核漿移位、各類炎癥指標(biāo)的變化、腎臟功能及膿毒癥小鼠的生存時(shí)間;2、探討SIRT1激活去乙�；疕MGB1的具體機(jī)制。通過(guò)上述研究為臨床上SA-AKI的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的思路。第一部分 HMGB1在膿毒癥小鼠血清和腎臟細(xì)胞中的表達(dá)和移位方法參照我們既往文獻(xiàn),復(fù)制SA-AKI小鼠模型。根據(jù)CLP的作用時(shí)間不同分為111個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn):0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20h。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清HMGB1 的蛋白水平。應(yīng)用Western Blot檢測(cè)腎皮質(zhì)細(xì)胞中HMGB1和SIRT1的蛋白表達(dá),HMGB1 的核漿移位。采用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)聯(lián)合Western Blot測(cè)定HMGB1的乙�；健８鶕�(jù)我們既往研究,腎小管上皮細(xì)胞在SA-AKI發(fā)生中具有重要的作用,因此,我們通過(guò)LPS刺激的人腎小管上皮細(xì)胞(human kidney 2 cell,HK-2)構(gòu)建SA-AKI相關(guān)的細(xì)胞模型。根據(jù)LPS刺激的時(shí)間不同,分為對(duì)應(yīng)的觀察點(diǎn),檢測(cè)的指標(biāo)和方法和動(dòng)物模型。結(jié)果1.CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠血清HMGB1含量進(jìn)行性升高,腎臟組織HMGB1含量進(jìn)行性減少。2.CLP后腎臟細(xì)胞HMGB1核漿位移增多、乙�；缴�。第二部分干預(yù)SIRT1對(duì)HMGB1的蛋白表達(dá)、核漿移位和乙酰化水平的影響方法復(fù)制盲腸套扎穿刺(CLP)誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型及LPS刺激HK-2細(xì)胞模型。SIRT1的激動(dòng)和抑制分別采用特異性的激動(dòng)劑SRT1720和特異性抑制劑Ex527。動(dòng)物買驗(yàn)分為四組:假手術(shù)(sham組)、CLP+Vehicle組、CLP+SRT1720組和CLP+EX527組。根據(jù)我們既往研究,腎小管上皮細(xì)胞在SA-AKI發(fā)生中具有重要的作用,因此,我們通過(guò)LPS刺激的人腎小管上皮細(xì)胞(human kidney 2 cell,HK-2)構(gòu)建SA-AKI相關(guān)的細(xì)胞模型。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)先后通過(guò)SIRT1化學(xué)激動(dòng)劑和抑制劑,以及SIRT1的siRNA來(lái)證實(shí)。其中根據(jù)化學(xué)激動(dòng)、抑制的處理?xiàng)l件不同分為對(duì)照組(Control)組、LPS+Vehicle組、LPS+SRT1720組和CLP+EX527組。針對(duì)SIRT1的干擾條件不同分別為con-siRNA組、con-siRNA+LPS組、SIRTlsiRNA組和 SIRT1siRNA+LPS組。通過(guò)Western Blot法檢測(cè)SIRT1和HMGB1的蛋白表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的分布,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)法驗(yàn)證SIRT1和HMGB1的相互作用,使用特異性的賴氨酸位點(diǎn)抗體WestemBlot法探討SIRT1去乙酰化HMGB1的賴氨酸位點(diǎn)。結(jié)果1.激動(dòng)SIRT1使CLP誘導(dǎo)膿毒癥小鼠腎臟HMGB1核漿位移減少,乙�；浇档汀IRT1抑制則結(jié)果相反。2.細(xì)胞模型證實(shí)激動(dòng)和抑制(下調(diào))SIRT1的結(jié)果和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致。3.SIRT1和HMGB1存在相互作用關(guān)系,SIRT1去乙酰化HMGB1的主要賴氨酸位點(diǎn)依次為K29,K28,K30。第三部分驗(yàn)證SIRT1去乙�；疕MGB1對(duì)膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)、腎臟病理及整體生存的影響方法復(fù)制CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型,根據(jù)處理?xiàng)l件不同分為四組:sham組、CLP+Vehicle組、CLP+SRT1720組和CLP+EX527組。通過(guò)Western Blot法檢測(cè)腎臟組織TLR2、TLR4和RAGE受體的表達(dá),ELISA法檢測(cè)血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-lp的含量,常規(guī)方法檢測(cè)血清BUN和Cr含量,腎臟組織病理以及腎小管細(xì)胞的凋亡,觀察小鼠的生存時(shí)間和72h生存率。結(jié)果1.激動(dòng)SIRT1去乙�；疕MGB1可以抑制膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)。2.激動(dòng)SIRT1去乙酰化HMGB1可以使膿毒癥小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少,腎功能改善,生存時(shí)間延長(zhǎng),生存率增加。結(jié)論1.SA-AKI相關(guān)的動(dòng)物和細(xì)胞模型中HMGB1乙�；潭仍黾�,HMGB1核漿移位和細(xì)胞外分泌增加。2.SA-AKI相關(guān)的動(dòng)物和細(xì)胞模型中,SIRT1激動(dòng)可以下調(diào)HMGB1的乙�；�,核漿移位減少。3.SIRT1去乙酰化HMGB1的主要賴氨酸位點(diǎn)依次為K29,K28,K30。4.激動(dòng)SIRT1能夠減輕CLP誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng),抑制細(xì)胞凋亡,改善腎功能,增加小鼠整體生存時(shí)間。
【圖文】：

ｓｉｒｔｕｉｎ。ＳＩＲＴ１在胚胎發(fā)育［７３’７４１和骨骼肌的分化［７５］過(guò)程中扮演很重要的作用。在逡逑細(xì)胞中具有很多不同的作用，包括染色質(zhì)的修飾、代謝途徑的表觀學(xué)遺傳、炎逡逑癥和應(yīng)激反應(yīng)等［７６１邋（圖２）。ＳＩＲＴ１通過(guò)結(jié)合一些組蛋白和非組蛋白底物發(fā)揮去逡逑乙�；饔�。ＳＩＲＴ１會(huì)優(yōu)先的去乙酰化組蛋白的特定位點(diǎn)如Ｈ４Ｋ１６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋１６邋ｏｆ逡逑ｈｉｓｔｏｎｅ邋４）、Ｈ３Ｋ９邋（ｌｙｓｉｎｅ邋９邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋３）、Ｈ３Ｋ５６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋５６邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋３）邋［７７］逡逑和Ｈ１Ｋ１６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋１６邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋１）來(lái)促進(jìn)異染色質(zhì)形成和轉(zhuǎn)錄沉默［７８’７９］。ＳＩＲＴ１逡逑的非組蛋白底物包括且不限于：腫瘤抑制因子Ｐ５３、ＮＦ－ｋＢ、ＰＧＣ－ｌｃｔ、ＦＯＸＯ、逡逑ｌｉｖｅｒ邋Ｘ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋（ＬＸＲ）、ＰＡＲＰ、Ｋｕ７０、（ＨＩＦ）－ｌａ［６３’８０—８７］。逡逑ＥＢ－琴逡逑＿Ｌ／／邋｜、逡逑■ｓａ邋W邋Ｉ邋ｎｐ逡逑圖２：邋ＳＩＲＴ１在機(jī)體和疾病中的調(diào)控作用。激動(dòng)ＳＩＲＴ１可以使組蛋白和非組蛋白底物去乙酰逡逑化增加來(lái)影響多種細(xì)胞進(jìn)程。（Ｐｏｕｌｏｓｅ，邋Ｎ．邋ａｎｄ邋Ｒ．邋Ｒａｊｕ，，邋Ｓｉｒｔｕｉｎ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ａｇｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｉｎｊｕｒｙ．逡逑Ｂｉｏｃｈｉｍ邋Ｂｉｏｐｈｙｓ邋Ａｃｔａ，邋２０１５．邋１８５２（１１）：邋ｐ．邋２４４２－５５．）逡逑５逡逑

圖３：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的技術(shù)路線圖
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2671988