【摘要】：【目的】造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs):指存在于造血組織中尚未發(fā)育成熟的所有血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的前體細(xì)胞,具有自我更新和多系分化的雙向潛能,HSCs的自我更新和多向分化潛能主要通過(guò)體內(nèi)移植來(lái)評(píng)估和判斷。成體HSCs主要存在于骨髓,通過(guò)不斷分化產(chǎn)生各系造血祖細(xì)胞,再而分化成各系血細(xì)胞,為造血系統(tǒng)提供新細(xì)胞;同時(shí)HSCs通過(guò)自我更新以維持自身數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定。HSCs作為一類(lèi)重要的成體干細(xì)胞在臨床中得到廣泛應(yīng)用,但在所有組織中比例都極低,因此尋找效率更高的富集HSCs的方法在其特性研究中至關(guān)重要。Kent等人通過(guò)給輻射后的小鼠移植骨髓ESLAM(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48~-)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其能夠在受體小鼠體內(nèi)維持長(zhǎng)期造血重建,證實(shí)該組合分離的細(xì)胞群中含有較高純度的造血干細(xì)胞。2016年Eaves等人用該表面標(biāo)志組合分離正常成年CD45.2小鼠骨髓細(xì)胞獲得純度達(dá)40%-50%的HSCs。通常把某種物質(zhì)的含量在百萬(wàn)分之一以下稱為痕量,即極少的量,本研究就是使用ESLAM組合分選獲取成體小鼠骨髓HSCs,建立痕量骨髓HSCs的移植體系,分析移植后重建及各系的分化情況�！痉椒ㄅc結(jié)果】第一部分:建立痕量骨髓HSCs的移植體系。參考Eaves 2016年的文章選擇分選HSCs的抗體組合即ESLAM組合(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48~-),GFP小鼠作為供體,流式細(xì)胞分選GFP小鼠骨髓細(xì)胞,30 cells/mice加骨髓細(xì)胞保護(hù)細(xì)胞,共同移植給致死劑量照射的受體小鼠,不同時(shí)間點(diǎn)依次對(duì)受體小鼠進(jìn)行尾靜脈采血流式細(xì)胞儀分析測(cè)嵌合,觀察其重建水平及譜系分化情況,接著處死受體小鼠,獲取骨髓、胸腺、脾臟和外周血等組織的細(xì)胞,測(cè)各組織嵌合情況。結(jié)果顯示每只受體小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的嵌合以及各譜系各組織的重建比例均有差異。第二部分:通過(guò)分析造血譜系細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果,進(jìn)一步詮釋成體骨髓HSCs的分子異質(zhì)性,從而解釋移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各譜系各組織嵌合差異的現(xiàn)象。該部分研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得1920個(gè)造血譜系細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果,篩選出1656個(gè)單細(xì)胞做后續(xù)分析。對(duì)納入分析的所有細(xì)胞進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄組的分群,共17個(gè)亞群,發(fā)現(xiàn)新的分群結(jié)果中有亞群與表面標(biāo)志組合定義的ESLAM群體有較高一致性,幾乎包含所有的ESLAM細(xì)胞。這群細(xì)胞具有高表達(dá)EPCR(CD201),Slamf1(CD150),Ly6a(Sca-1),低表達(dá)CD34,CD48等特征。為了更好闡釋轉(zhuǎn)錄組水平HSCs的分子異質(zhì)性,我們對(duì)轉(zhuǎn)錄組水平定義的LT-HSCs進(jìn)行了異質(zhì)性分析,將LT-HSCs分為了4個(gè)亞群,分析了四個(gè)亞群的特征以及細(xì)胞周期的特性,發(fā)現(xiàn)LT-HSCs中存在一群細(xì)胞周期活躍且高表達(dá)紅系特征的細(xì)胞,結(jié)果表明這群表面標(biāo)志與ESLAM高度一致的細(xì)胞群可能具有紅系分化傾向性。第三部分:探索小鼠骨髓損傷模型,基于對(duì)骨髓HSCs的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,參照以往動(dòng)物骨折模型,希望建立骨髓損傷模型并探索骨髓干細(xì)胞在骨髓損傷中的應(yīng)用,但從骨髓損傷模型建立后的組織學(xué)及影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果以及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的量化方面來(lái)看,該模型仍然需要改進(jìn)�！窘Y(jié)論】以上研究結(jié)果表明ESLAM組合能夠較高效率的富集具有長(zhǎng)期重建能力的HSCs;且這群細(xì)胞移植后6個(gè)月外周血結(jié)果提示可能具有紅系和巨核分化傾向。
【圖文】：

械工作臺(tái)（亞泰科�。�、臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf 5804R）、低-15R Beckman）、流式細(xì)胞儀（BD FACSAria Ⅱ，Calibur）、流e）、冰箱（Siemens）、靜音混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有、解剖剪（HOROTEC）、解剖鑷（HOROTEC）、細(xì)胞培養(yǎng)皿（ 孔培養(yǎng)板（Costar）、細(xì)胞濾膜（FALCON 40um）、注射器（廣限公司）1ml。骨髓 HSCs 的痕量細(xì)胞移植整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程主要包括全骨髓細(xì)胞分選，HSCs 的移植以及移植后檢測(cè)等步驟(圖 1-1)。

1.2.2 骨髓細(xì)胞抗體標(biāo)記骨髓細(xì)胞懸液離心（310g,6 min）棄上清（以下沒(méi)有特殊提到的細(xì)胞離心均為此規(guī)格），洗液洗 1-2 次，離心棄上清，，100ul1% BSA/PBS 重懸，按照抗體說(shuō)明書(shū)用量，加入抗體(抗體詳細(xì)信息見(jiàn)表 1): APC anti-CD201（EPCR）,PE-cy7Anti-CD45,APC-eFluor780 CD48, PE anti-CD150(SLAM)，4℃靜音混合器避光反應(yīng)30min，抗體中和液中和，離心棄上清，洗液洗 1-2 次, 200ul 1% BSA/PBS 重懸細(xì)胞，無(wú)菌細(xì)胞濾膜濾過(guò)去掉細(xì)胞團(tuán)塊，導(dǎo)入流式管中，準(zhǔn)備流式分選。1.2.3 流式細(xì)胞儀分選 HSCs使用 Aria II (BD)進(jìn)行細(xì)胞分選, 使用前調(diào)節(jié) drop delay 使液流穩(wěn)定。按照 Fig2 方式分選目的細(xì)胞（ESLAM 細(xì)胞）。收集板為 200ul 移植液/孔的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔收 30 細(xì)胞，共收 5 孔，使用 Purity 模式分選（圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R457.7

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本文編號(hào)：2671635