【摘要】：食品和飲用水安全直接關(guān)系人們身體健康和生命安全,發(fā)展對食品和飲用水質(zhì)量的快速檢測技術(shù)是確保食品和飲用水質(zhì)量的重要保證。細菌感染是引起食物中毒的主要原因之一,尤其致病菌引起的食物污染能引起更嚴重的后果,本論文研究的腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7能引起嚴重疾病甚至死亡,其感染劑量低,輕者腹瀉、便血,重者可得急性腎衰竭,快速檢測和鑒定EHEC O157:H7是預防和有效治療的關(guān)鍵。目前對于EHEC O157:H7的檢測通常采用最傳統(tǒng)的平板計數(shù)法,其可信度高,但步驟繁瑣耗時過長。為了快速檢測并鑒定樣品中是否含有EHEC O157:H7,本論文利用抗原和抗體之間的特異性識別作用,采用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建了基于平面基底和三維微納結(jié)構(gòu)基底的生物傳感器,進而結(jié)合魚骨結(jié)構(gòu)PDMS芯片的渦旋攪拌效果,開發(fā)了能特異性捕獲EHEC O157:H7的高級微流控芯片,并構(gòu)建了集EHEC O157:H7捕獲、培養(yǎng)、釋放、裂解、擴增于一體的芯片實驗室。論文的主要研究內(nèi)容如下:本論文利用層層自組裝技術(shù)制備了基于平面基底的碳納米管多層膜的生物傳感器,對EHEC O157:H7的捕獲效率和檢測下限進行研究,結(jié)果顯示捕獲效率約為60%,檢測下限為1 CFU/m L。此外,此生物傳感器還具有專一性、生物相容性、重復使用性、穩(wěn)定性以及實際應用性。為了增強基底與EHEC O157:H7的接觸面積和進一步提高其捕獲效率,采用納米壓印技術(shù)制備了具有三維微納結(jié)構(gòu)的基底,研究表明三維微納結(jié)構(gòu)的存在有利于提高EHEC O157:H7的捕獲效率。通過圖形尺寸、高度、間隔的優(yōu)化,篩選出最優(yōu)的三維微納結(jié)構(gòu)為邊長為6μm,高度為2μm,間隔為2μm,進一步修飾碳納米管薄膜后可將最優(yōu)三維微納結(jié)構(gòu)基底構(gòu)建的生物傳感器對EHEC O157:H7的捕獲效率提高到80%,檢測下限為1 CFU/m L。此外,此生物傳感器還具有良好的專一性、生物相容性、穩(wěn)定性和實際應用性。為促進EHEC O157:H7與傳感器的接觸進而提高其捕獲效率,本論文構(gòu)建了基于ITO基底和最優(yōu)三維微納結(jié)構(gòu)基底的微流控芯片。微流控芯片上層采用具有魚骨結(jié)構(gòu)的PDMS芯片,實驗證明魚骨結(jié)構(gòu)對流體具有渦旋攪拌的效果,增強了EHEC O157:H7的捕獲效率,其中魚骨結(jié)構(gòu)PDMS芯片與最優(yōu)三維微納結(jié)構(gòu)基底組合的微流控芯片具有高達95%的細菌捕獲效率,檢測下限為1CFU/m L。此微流控芯片不僅具有優(yōu)越的細菌捕獲性能,還具有較好的專一性和良好的實際應用前景。為了滿足對EHEC O157:H7定性定量的要求,同時又能減少昂貴儀器的使用,本論文結(jié)合分子生物學檢測手段環(huán)介導等溫擴增技術(shù),制備了八平行通道微流控芯片,利用光纖濁度傳感器,實現(xiàn)了對EHEC O157:H7的定性定量檢測。進而將ITO基底構(gòu)建的阻抗型傳感芯片與八平行通道環(huán)介導等溫擴增微流控芯片組合,實現(xiàn)了EHEC O157:H7的捕獲、培養(yǎng)、釋放、裂解、擴增DNA一體化檢測,檢測時間少于3.5小時,檢測下限為1 CFU/m L。在此基礎(chǔ)上,將具有三維微納結(jié)構(gòu)的阻抗型芯片與微流控芯片整合為一體化多功能芯片,實現(xiàn)了EHEC O157:H7的一體化檢測。綜上所述,本論文將EHEC O157:H7的捕獲效率提高到了95%,檢測下限減小到1 CFU/m L,并且實現(xiàn)了EHEC O157:H7的定性定量一體化快速靈敏檢測。
【圖文】：

哈爾濱工業(yè)大學工學博士學位論文行連接，所以當加入底物 TMB 時會出現(xiàn)顏色反應，從而證明7:H7 的存在。此種方法檢測時間為 15-30 min，檢測限為 500 個細5 年，張磊等人利用一步合成法合成花狀金納米粒子，并用鼠抗7:H7 修飾金納米粒子去捕獲 EHEC O157:H7，然后包含有金納米C O157:H7 的樣品加入試紙條的樣品區(qū)，在毛細作用下，樣品向前 EHEC O157:H7 和 T 線上相應抗體的相互識別，，最終金納米粒子7:H7 的復合物被固定在 T 線上，從而導致金納米粒子的聚集而使得這一現(xiàn)象可以被用來定量檢測 EHEC O157:H7。其余被標記的金納向前遷移，由于標記金納米粒子的抗體與 C 線上抗體的專一性識記的金納米粒子固定在 C 線上，如圖 1-4 所示。此種方法的檢測限CFU/mL[58]。

將細菌捕獲之后與二抗相連，二抗通過生物素和抗生物素蛋白之間的識別作用與葡萄糖氧化酶相連，葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖，產(chǎn)生過氧化氫。在過氧化氫形成后，通過檢測化學發(fā)光強度來檢測EHEC O157:H7，如圖1-5所示。在最優(yōu)條件下，線性檢測范圍為4.3×103-4.3×105CFU/mL，檢測時間小于2 h，檢測限為1.2×103CFU/mL，低于酶聯(lián)免疫反應的檢測限（1.0×105CFU/mL）。而且，這種方法被成功的用來檢測合成樣品中的EHEC O157:H7（泉水，蘋果汁和脫脂牛奶），展現(xiàn)了它檢測實際樣品的能力[4]。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 吳大成;孫洋;袁潔;康樺華;郭學軍;祝令偉;陳志虹;向蓉;馮書章;;雙抗夾心ELISA檢測腸出血性大腸桿菌O157方法的建立[J];中國獸醫(yī)學報;2011年12期

2 邱素君;呂春華;楊冬梅;;產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的研究進展[J];草食家畜;2009年03期

3 樊蕊,劉謙民;腸出血性大腸桿菌O157∶H7研究進展[J];臨床醫(yī)藥實踐;2003年08期

本文編號：2665489