【摘要】：目的:抗生素抗性細菌(Antibiotic resistant bacteria,ARB)嚴重威脅全球公共健康。為有效控制細菌抗生素抗性的產生及其傳播速度,亟待發(fā)現導致ARB在環(huán)境中的產生和傳播的可能因素并闡明其機理。傳統(tǒng)的水消毒工藝并不能殺滅所有細菌,往往會有部分抵抗力較強的細菌殘存,其中,部分細菌仍然保持未損傷狀態(tài)存在,而部分細菌則會形成一種傳統(tǒng)方法無法檢測出的特殊生理狀態(tài)細菌——亞致死損傷細菌。目前尚未見細菌的生理狀態(tài),尤其是損傷狀態(tài)與抗生素抗性提高之間存在關聯的文獻報道�；谝陨献龀隽思毦膿p傷狀態(tài)能夠提高抗生素抗性這一假設。本課題的目的是研究消毒對細菌抗生素抗性的影響,驗證細菌的損傷狀態(tài)與抗生素抗性提高之間是否存在關聯性并初步探討其機制,為消毒促進水中抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)轉移和傳播的機制研究提供理論依據。方法:1.次氯酸鈉暴露和UV照射對細菌抗生素抗性的影響:以銅綠假單胞菌為研究對象,采用不同劑量次氯酸鈉或UV照射不同時間后,利用微量肉湯稀釋法測定暴露后的細菌對13種代表性抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC);同時,采用可見光法檢測暴露后細菌的CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶等抗氧化酶活性;最后,使用Spearman秩相關分析損傷細菌濃度與抗生素MIC值之間的相關性。2.暴露后細菌提高抗生素抗性的機制:提取次氯酸鈉暴露和UV照射后的細菌RNA并進行轉錄組學測序,通過差異表達分析,發(fā)現與細菌提高抗生素抗性有關的關鍵基因,并通過SYBR Green熒光定量PCR方法進行驗證,最終提出消毒促進細菌提高抗生素抗性的可能機制。3.生活飲用水損傷細菌的抗生素抗性調研:分離生活飲用水中損傷細菌,通過16S rRNA測序或生化鑒定試劑盒進行菌株鑒定,并采用微量肉湯稀釋法測定各分離株的MIC值。結果:1.4 mg/L次氯酸鈉作用20 min的銅綠假單胞菌致死率為50%(半數致死劑量LD_(50)),該劑量下損傷細菌對氨芐西林(ampicillin,AMP)、氯霉素(chloramphenicol、CHL)、頭孢他啶(ceftazidime,CAZ)的MIC分別提高2,2,5.6倍,且MIC值與LD_(50)下損傷細菌濃度成正相關;CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶含量比暴露前提高了3.26,5.18,4.79倍;轉錄組學分析結果表明,細菌RND家族藥物外排泵表達顯著性上調的基因種類最多且mex EF-oprN相關基因上調最為明顯,qPCR結果也驗證了mex E、oprP基因表達上調。同時,2 mg/L、8 mg/L次氯酸鈉作用20 min下的細菌致死率分別為20%、90%,但對MIC值均未見明顯提高。2.經11mJ/cm~2 UV照射劑量暴露后,銅綠假單胞菌對四環(huán)素(tetracycline,TET)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、多粘菌素B(polymyxin b PLB)的MIC值分別提高了8.4,4.4,2倍;但MIC值與損傷細菌濃度無明顯相關性;CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶含量比UV暴露前提高了105.42,69.95,3.54倍;轉錄組學分析結果表明,細菌藥物外排泵家族基因表達顯著上調,qPCR結果驗證了RND家族外排泵mexC表達上調。3.從12份自來水水樣中,共計分離出150株損傷菌,涉及12個細菌種屬,其中假單胞菌屬最多,占38%。與質控菌相比,90%以上的損傷菌分離株表現出抗生素抗性增強,其中銅綠假單胞菌分離株對AMP、CHL、CAZ、TET、CIP、PB的MIC值均有所提高,且對CAZ的的MIC值提高倍數最大,達到了128倍。芽孢菌屬出現了五重抗生素抗性。結論:1.次氯酸鈉半致死劑量暴露下的銅綠假單胞菌可顯著提高其抗生素抗性,且與其中的損傷細菌濃度顯著相關。其機制可能主要與mexEF-oprN外排泵基因的表達上調有關。2.UV暴露可使銅綠假單胞菌的抗生素抗性提高,但與損傷細菌濃度無顯著相關性。其機制主要與mexC外排泵家族基因表達上調有關。3.多數自來水中的損傷菌分離株對抗生素呈現較強抗性,假單胞菌屬最多。上述研究結果表明,次氯酸鈉消毒和UV消毒造成了細菌損傷,損傷細菌抗生素抗性增強,能夠威脅飲用水安全。
【圖文】：

圖 2-1 轉錄組信息分析流程Figure 2-1 Pipeline of bioinformatics analysis2.2.2.8 關鍵差異表達基因的驗證采用 SYBR Green 熒光定量 PCR 方法對轉錄組學分析中有完整基因注鍵差異表達基因進行驗證。用 EZ-10 Spin Column 總 RNA 提取試劑盒提取RNA，樣品為 4 mg/L 次氯酸鈉暴露 1 min,5 min,20 min 的銅綠假單胞菌，為未暴露處理的細菌，步驟按照說明書進行。隨后使用 PrimeScript IIcDNA 合成試劑盒反轉錄得到 cDNA。引物序列參照文獻或委托寶生物公設計并分析其特異性。引物由寶生物公司合成。部分引物序列參照文獻[42-2 所示。表 2-2 引物序列Table 2-2 The primers for SYBR Green qPCR基因 序列 5'-3' 產物長度mexE-F ATCCGGCACCGCTGAAGGCTGCG 114mexE-R CGACAACGCCAAGGGCGAGTTCACC

Ct(目的基因) － △Ct(標準值)；目的基因的相對表達為 2－ ΔΔCt。2.9 數據統(tǒng)計與分析菌的損傷率與致死率，MIC 值計算用 Excel 進行統(tǒng)計，抗氧化酶活性的處否有統(tǒng)計學差異的比較使用 SPSS 22.0 進行多個獨立樣本的單因素方差傷細菌濃度與對不同抗生素的 MIC 值之間的相關性使用 SPSS 22.0 進an 秩相關分析。2.3 結果1 次氯酸鈉作用下的細菌存活規(guī)律與損傷細菌形成規(guī)律 2，，4，8 mg/L 的次氯酸鈉作用下的銅綠假單胞菌的存活規(guī)律與損傷細菌如圖 2-2，2-3 所示。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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3 堯榮鳳;許國祥;陶振東;薛龍;李智;徐龍;;醫(yī)院臨床常見細菌耐藥性監(jiān)測[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2015年05期

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本文編號：2617845