【摘要】：目的:研究膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)對因為膿毒癥而出現(xiàn)的骨骼肌煙堿型乙酰膽堿受體異化重構(gòu)的調(diào)控作用,然后深入研究該因子對膿毒癥大鼠骨骼肌神經(jīng)肌肉功能障礙的改善作用。方法:選取健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠60只,在對它們進行研究時采用隨機數(shù)字表的方法把60只大鼠平均分為六個小組(n=10):假手術(shù)組(sham組),4小時組(4 h組),6小時組(6 h組),12小時組(12 h組),24小時組(24 h組)和GDNF+24小時組(GDNF+24h組),sham組僅進行開腹盲腸探查,其余組均進行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal ligation and puncture,CLP)構(gòu)建相應(yīng)的膿毒癥模型。對于每個小組,在進行建�；蚣偈中g(shù)后的1小時內(nèi),從大鼠的腹主動脈以及尾靜脈中抽取一定量的血液作為樣本,然后通過ELISA法對所取的樣本進行檢測,檢驗血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)的含量,然后對其進行建�；蜻M行假手術(shù),觀察觀察大鼠的存活率以及各個大鼠活動的距離和進行直立的次數(shù)。麻醉大鼠,解剖分離大鼠坐骨神經(jīng),測定大鼠在體脛前肌復(fù)合動作電位(Compound muscle action potential,CMAP),高濃度二氧化碳處死大鼠,采集所需要的標本。取大鼠的脛前肌,通過免疫熒光法準確測量γ-nAChR,α7-n ACh R和GFR-α在大鼠脛前肌細胞膜上具體的排列方式以及表達方式;然后運用Western-blot對所選擇標準中的γ-n AChR,α7-nAChR,neuregulin-1,GFR-α,ERK1/2和GDNF的蛋白具體表達數(shù)量進行詳細準確的測定。結(jié)果:(1)細胞因子水平:與sham組比較,CLP組IL-6以及TNF-α水平有著明顯的提升,而且隨著建模后時間點的不斷延長,其水平含量也相應(yīng)的逐漸增加,存在的差異在統(tǒng)計學上具有實際意義(P0.05)。(2)比較各組大鼠直立的次數(shù):在直立次數(shù)比較中,CLP組較sham組直立次數(shù)明顯減少,且隨著CLP建模時間點的延長,大鼠直立次數(shù)逐漸下降,存在的差異在統(tǒng)計學上具有實際的意義(P0.05)。(3)大鼠在體脛前肌復(fù)合動作電位(CMAP)的比較:大鼠在體脛前肌復(fù)合動作電位的比較中,與sham組相比,CLP組動作電位的振幅,頻率,傳導速度和潛伏期較sham組均有所增加,且隨著CLP建模時間點的延長,大鼠脛前肌動作電位相應(yīng)的指標均逐漸增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)采用免疫熒光法測定γ-nAChR,α7-nAChR和GFR-α在大鼠脛前肌細胞膜上的表達:γ-nAChR,α7-nACh R和GFR-α均在細胞膜上表達,與sham組相比,CLP組γ-nAChR,α7-nAChR和GFR-α的熒光強度有顯著增強,且隨著CLP建模時間點的延長,熒光強度逐漸增加。(5)Western-blot對所選擇的標本中γ-nAChR,α7-nAChR,neuregulin-1,GFR-α,ERK1/2和GDNF的蛋白表達量進行準確的測定:與sham組相比,CLP組γ-nAChR,α7-nAChR表達增加,且隨著建模時間點的延長γ-nAChR,α7-nAChR,GFR-α和ERK1/2表達逐漸增加,neuregulin-1和GDNF的表達逐漸降低,存在的差異在統(tǒng)計學上具有實際意義(P0.05)。結(jié)論:(1)膿毒癥的存在在一定程度上會促使骨骼肌細胞膜上異質(zhì)化的乙酰膽堿受體γ-nAChR,α7-nAChR的表達活性有所提升,并且遍布于骨骼肌整個細胞膜上。(2)在膿毒癥急性期24小時內(nèi),隨著時間的延長,大鼠骨骼肌CMAP呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,骨骼肌神經(jīng)肌肉功能障礙逐漸加重。(3)在膿毒癥急性期24小時內(nèi),隨著時間的延長,γ-nAChR,α7-nAChR的表達逐漸增多,保護性因素neuregulin-1和GDNF的表達逐漸降低。(4)外源性給予GDNF可以通過減少γ-和α7-n AChR的表達,從而能夠改善膿毒癥導致的骨骼肌神經(jīng)肌肉功能障礙。(5)GDNF是通過胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2和GDNF受體GFR-α信號轉(zhuǎn)導通路來發(fā)揮神經(jīng)功能調(diào)節(jié)作用的。
【圖文】：

實驗要求的用均數(shù)土標準差（-X ±s 表示。且應(yīng)用單因素方差（ANOVA)分析同組間的差異，應(yīng)用 SNK-q 檢驗對比分析兩組間的差異。以 P 是否小于 0.05 來確定其是否旅有統(tǒng)計學意義。2.結(jié)果2.1 膿毒癥建模后表現(xiàn)2.1.1 動物行為學如下圖 1 所示，Sham 組大鼠建模后活動以及飲食都無異常出現(xiàn)，在被抓取時能夠反應(yīng)敏捷地躲避，排泄物也正常。CLP 組大鼠在建模后進食量顯著降低，毛發(fā)呈豎直狀態(tài)，活動量也顯著降低，身體蜷縮， 在被抓取時不能夠反應(yīng)敏捷地躲避。大鼠行為學示意圖

able to avoid aggression and seizures when crawled. After CLP group rats were f intake was significantly reduced, the hair was vertical, the activity was signifced, the body was curled up, and it was not able to respond quickly when caught. 動物直立次數(shù)如圖 2 所示，在完成建模或手術(shù)后在相同的時間階段，對比分析 CLP 組 組，得出患有膿毒癥的大鼠直立次數(shù)顯著降低，且 P＜0.05 差異具有統(tǒng)。當 12 h 組和 24 h 組的大鼠與 sham 組進行對比時，發(fā)現(xiàn) 12h 與 24h 組的顯著降低，且 p＜0.05 具有統(tǒng)計學意義。并且隨著建模時間的延長，與 4h 組比較，24h 組的大鼠直立次數(shù)顯著降低，且 P＜0.05 因此差異具有義。各組大鼠直立次數(shù)指標示意圖
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7

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本文編號：2606398