【摘要】：背景與目的干細胞移植在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病治療的研究領域中取得了顯著地進展,但干細胞與腫瘤細胞關系密切,都具有自我更新和多向分化能力,不僅有相似的代謝活性,而且有很多相同的沉默基因。近年來關于干細胞成瘤的報道使干細胞移植安全性被質疑,而且移植部位常發(fā)生在脊髓、腦、眼等較敏感的部位,即使形成很小的腫瘤都會導致嚴重的功能障礙,移植后干細胞的示蹤可盡早檢測到腫瘤的發(fā)生。在干細胞活體影像學示蹤領域,主要利用光學、核醫(yī)學以及磁共振成像(MRI),其中,MRI因具有三維多序列成像且高分辨率無輻射等優(yōu)點而最具潛力。MRI示蹤干細胞常用方法包括直接和間接兩種方法,直接示蹤法應用磁性納米微粒先標記干細胞并利用MRI對磁標記細胞進行檢測,但是由于細胞的分裂及再攝取等問題限制其對干細胞的長期縱向示蹤;間接示蹤法常采用MRI報告基因標記干細胞,并利用其在細胞內(nèi)的持續(xù)表達來示蹤干細胞,有效克服了直接示蹤法不能對細胞進行長期示蹤的缺陷。雖然MRI報告基因成像可實現(xiàn)對干細胞移植后的長期縱向示蹤,但無法區(qū)分早期瘤變細胞和瘤變前的干細胞。解決這一問題的關鍵在于找到一種在干細胞瘤變前后差異化表達的基因,該基因在瘤變細胞內(nèi)高表達,而在干細胞及其正常分化的組織細胞不表達或低表達,利用該基因的啟動子驅動報告基因在瘤變細胞內(nèi)特異性表達,理論上可以實現(xiàn)報告基因成像對干細胞瘤變的早期檢出。PEG3(progression elevated gene-3)是一種來源于嚙齒動物的腫瘤特異性基因,在腫瘤細胞中,PEG3啟動子活性受到PEA3、AP-1兩種轉錄因子的調(diào)節(jié)而高表達。該基因在人癌細胞系同樣高表達,而在正常組織細胞極少表達;目前PEG3啟動子已被用于腫瘤的靶向治療和腫瘤的發(fā)生機制等研究領域。有關利用PEG3啟動子驅動報告基因對干細胞瘤變進行活體成像的研究尚未見文獻報道。本實驗將腫瘤特異性啟動子PEG3與MRI報告基因FTH1相結合,構建PEG3-FTH1-LV慢病毒載體,將PEG3-FTH1系統(tǒng)轉入大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)內(nèi),并誘導MSCs瘤變,在誘導前后觀察FTH1基因表達、聚鐵效應以及MRI信號改變,探究利用PEG3啟動子驅動MRI報告基因FTH1在干細胞瘤變時特異性表達及聚鐵,并被MRI檢測的可行性。方法1 PEG3-FTH1-LV慢病毒載體的構建及病毒包裝PEG3啟動子、FTH1基因(委托漢恒生物有限公司合成)與載體p HBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro通過酶切、擴增、連接得到pHBLV-PEG3-FTH1-3flag-EF1-ZSgreen-puro,測序鑒定構建成功后與質粒(p SPAX2、p MD2G)同時感染293T細胞,收集病毒液離心得到病毒并標記為PEG3-FTH1-LV。同時構建CMV-FTH1-LV作為陽性對照,并將未感染病毒的MSCs細胞作為陰性對照。2慢病毒感染MSCs并誘導瘤變待MSCs細胞融合度達30%-40%,分別添加含PEG3-FTH1-LV、C MV-FTH1-LV病毒培養(yǎng)基,感染48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達,嘌呤霉素篩選構建穩(wěn)定表達株MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CM V-FTH1。將MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1分別與大鼠膠質瘤細胞C6間接共培養(yǎng)2周誘導其瘤變?yōu)門MSCs、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1。3誘導前后細胞的鑒定觀察共培養(yǎng)前后細胞形態(tài),細胞流式檢測共培養(yǎng)前后細胞表面抗體CD29、CD34、CD45、CD90表達情況,結晶紫染色檢測誘導前后細胞遷移能力,CCK-8檢測誘導前后細胞增殖速度,裸鼠皮下成瘤實驗驗證細胞瘤變。4誘導前后細胞FTH1表達及聚鐵Western blots檢測誘導前后細胞FTH1表達,誘導前后細胞分別經(jīng)FAC培養(yǎng)基作用72h后,3.0T MRI觀察細胞T2WI信號,普魯士藍染色、細胞透射電鏡觀察細胞誘導前后FTH1基因表達所引起的聚鐵效應。5誘導后細胞移植物聚鐵效應檢測選取4-6W、20g左右健康雄性裸鼠,將誘導后細胞種植于裸鼠頸背部皮下,每天500mmol/L FAC溶液喂養(yǎng),于細胞種植后第1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d行3.0T MR觀察移植物T2WI信號;細胞移植后形成的移植物取出后行普魯士藍染色及透射電鏡觀察腫塊內(nèi)鐵顆粒情況,行蘇木素-尹紅染色觀察其病理結構。結果1 PEG3-FTH1-LV慢病毒載體的鑒定及病毒包裝經(jīng)DNA測序、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳等技術測定已成功構建PEG3-FTH1-LV慢病毒載體,病毒滴度為1×108TU/ml。2穩(wěn)定株的建立慢病毒感染細胞48h后綠色熒光明顯表達,嘌呤霉素篩選7天再半量篩選3天后成功構建MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1穩(wěn)定株。3誘導前后細胞的鑒定顯微鏡下觀察到MSCs細胞排列整齊,呈魚群樣生長,TMSCs細胞較MSCs細胞變小,核漿比變大,并排列紊亂;經(jīng)CCK-8檢測顯示TMSCs細胞較MSCs細胞增殖速度加快;結晶紫染色結果顯示TMSs細胞較MSCs細胞遷移能力增強;流式細胞檢測結果分析得到TMSCs細胞較MSCs細胞CD34、CD45表達增加,CD90表達減少;裸鼠皮下成瘤實驗顯示TMSCs細胞裸鼠皮下成瘤陽性,而MSCs不形成腫瘤。4誘導前后細胞FTH1表達及聚鐵效應Western blots結果顯示MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、TMSCs細胞不表達或少量表達FTH1蛋白,而MSCs-CMV-FTH1、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1細胞均大量表達FTH1蛋白,MRI顯示T MSCs-PEG3-FTH1細胞T2WI信號較MSCs-PEG3-FTH1細胞明顯降低。普魯士藍染色和細胞透射電鏡觀察到MSCs-CMV-FTH1、TMSCsPEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1細胞內(nèi)存在鐵顆粒,而在MSCs、M SCs-PEG3-FTH1、TMSCs細胞內(nèi)無明顯鐵顆粒。5誘導后細胞移植物體內(nèi)聚鐵效應MRI顯示TMSCs-PEG3-FTH1細胞移植物信號與TMSCs-CMV-FT H1細胞移植物信號相似且均較TMSCs細胞移植物信號降低,普魯士藍染色和細胞透射電鏡均觀察到TMSCs-PEG3-FTH1與TMSCs-CMVFTH1細胞移植物內(nèi)有明顯的鐵顆粒而TMSCs細胞移植物內(nèi)鐵顆粒不明顯。結論本實驗成功構建PEG3啟動子控制FTH1基因表達的慢病毒載體并感染MSCs細胞,證實了PEG3啟動子可驅動報告基因FTH1在干細胞瘤變時特異性表達并能被MRI檢測。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文正置顯微鏡 OLYMPUS純水儀 Millipore0.22um 混合纖維素濾膜 Millipore細胞計數(shù)板 上海醫(yī)用儀器廠細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板 Costar1.3 慢病毒載體、菌株和細胞株1.3.1 病毒包裝系統(tǒng)慢病毒載體和包裝質粒 pMD2G、pSPAX2 （圖 1）。

ACCAACGAGGTGGCCGAATCTTCCTTCAGGATATCAAGAAACCAGACTGTGATGACTGGGAGAGCGGGCTGAATGCAATGGAGTGTGCATTACATTTGGAAAAAAATGTGAATCAGTCACTACTGGAACTGCACAAACTGGCCACTGACAAAAATGACCCCCATTTGTGTGACTTCATTGAGACACATTACCTGAATGAGCAGGTGAAAGCCATCAAAGAATTGGGTGACCACGTGACCAACTTGCGCAAGATGGGAGCGCCCGAATCTGGCTTGGCGGAATATCTCTTTGACAAGCACACCCTGGGAGACAGTGATAATGAAAGCGGATCCTCGGTACCAAGCTTAAGTGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATAAAGATCCATCGATACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAG與正確序列對比結果顯示無誤（圖 2）；
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R445.2;R457.7

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