發(fā)布時(shí)間：2020-03-22 15:05

【摘要】：隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇,癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的“頭號(hào)殺手”。靈敏可靠的檢測(cè)手段是實(shí)現(xiàn)腫瘤等重大疾病早期診斷,把握最佳治療時(shí)機(jī),提高治愈率的神兵利器。近年來(lái),隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)和納米技術(shù)的迅猛發(fā)展,各種新興的分析技術(shù)不斷涌現(xiàn)。免疫分析技術(shù)憑借其操作簡(jiǎn)單,對(duì)分析儀器要求不高且費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)志物分析檢測(cè)。本論文基于生物酶和納米材料來(lái)構(gòu)建性能良好的高分辨和雙信號(hào)的檢測(cè)方法,致力于提高免疫分析的靈敏度,同時(shí)通過(guò)多指標(biāo)特征值定量檢測(cè)目標(biāo)物,提高分析體系的可靠性和準(zhǔn)確性。本論文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1、脲酶介導(dǎo)的高分辨比色免疫分析方法的構(gòu)建及性能研究傳統(tǒng)的比色免疫分析方法通常是基于單一的從淺到深或從深到淺的顏色變化,當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)物濃度相近時(shí),顯色結(jié)果很難用肉眼區(qū)分,裸視的分辨率低。為解決這一難點(diǎn),我們提出通過(guò)脲酶催化尿素水解致使溶液的pH升高并引起酸堿指示劑的顏色變化,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物濃度依賴的多色高分辨信號(hào)的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中酸堿指示劑苯酚紅作為顯色劑,Ag~+作為脲酶抑制劑,我們通過(guò)堿性磷酸酶(ALP)催化抗壞血酸酯(AAO)的水解產(chǎn)生抗壞血酸(AA),進(jìn)而引起Ag~+的還原并解除對(duì)脲酶的抑制作用;脲酶催化尿素水解產(chǎn)生的氨使指示劑苯酚紅在pH 6.6~8.0范圍內(nèi)由黃色變?yōu)槌壬僮優(yōu)榧t色,實(shí)現(xiàn)了裸眼的定性和半定量檢測(cè),同時(shí)可以通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)或手機(jī)拍照實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)分析。本系統(tǒng)以兔免疫球蛋白(R IgG)為模型分析物,通過(guò)“三明治”夾心法將ALP修飾的特異性識(shí)別抗體引入檢測(cè)體系,再通過(guò)上述顯色體系實(shí)現(xiàn)定性或定量檢測(cè)。具體地:當(dāng)R IgG的濃度增加時(shí),ALP將催化產(chǎn)生的更多的AA來(lái)還原Ag~+,生成的銀單質(zhì)失去了抑制脲酶活性的功能,使脲酶催化尿素產(chǎn)生更多的氨氣,引起溶液pH升高和顏色由黃色向橙色和紅色轉(zhuǎn)變。通過(guò)模擬臨床樣本我們實(shí)現(xiàn)了在人血清中檢測(cè)R IgG,驗(yàn)證了該方法在實(shí)際應(yīng)用中的潛力。結(jié)果顯示即使在10%的人血清中存在許多干擾分子,但該實(shí)驗(yàn)仍可以有效地識(shí)別和捕獲R IgG,實(shí)現(xiàn)高選擇性和特異性目標(biāo)物檢測(cè)。在最佳條件下,R IgG的線性檢測(cè)范圍為0-18ng mL~(-1),最低檢測(cè)限為1.73 ng mL~(-1)。該比色結(jié)果直接使用智能手機(jī)獲取圖片,然后使用軟件Image J進(jìn)行定量分析,避免了昂貴而笨重的桌面設(shè)備的使用。2、基于鐵基金屬有機(jī)框架材料(Fe-MOFs)的雙信號(hào)免疫分析方法構(gòu)建及機(jī)理研究本實(shí)驗(yàn)采用溶劑熱法制備了具有發(fā)光特性和類氧化酶活性的Fe-MOFs,其中有機(jī)配體為2-氨基對(duì)苯二甲酸(BDC-NH_2)。我們利用Fe-MOFs的固有特性構(gòu)建了一種基于AA誘導(dǎo)發(fā)光增強(qiáng)和顏色抑制的新型雙信號(hào)(發(fā)光和比色)免疫分析方法。本實(shí)驗(yàn)中,Fe-MOFs作為響應(yīng)型熒光探針和催化TMB氧化顯色的類酶,為檢測(cè)體系提供熒光和比色兩種檢測(cè)信號(hào)。雙信號(hào)的變化很容易通過(guò)控制AA的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié),而AA的含量又通過(guò)免疫反應(yīng)引入的ALP進(jìn)行催化調(diào)節(jié)�；谏鲜鲈瓌t,首先我們使用Fe-MOFs作為熒光探針檢測(cè)AA,實(shí)現(xiàn)了最低檢測(cè)限為0.051μM的超靈敏檢測(cè)。我們進(jìn)一步將上述信號(hào)產(chǎn)生策略與酶聯(lián)免疫分析相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了人前列腺癌特異抗原(PSA)的高靈敏和高特異性檢測(cè)。當(dāng)系統(tǒng)中存在PSA時(shí),ALP標(biāo)記的抗體通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合引入到酶標(biāo)板上,隨之催化AAO產(chǎn)生AA并誘導(dǎo)Fe-MOFs呈現(xiàn)熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象,同時(shí)AA也將抑制Fe-MOFs催化TMB生成藍(lán)色的oxTMB,最終產(chǎn)生的熒光和比色雙信號(hào)通過(guò)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測(cè)試。在人血清中檢測(cè)PSA,檢測(cè)限為180 pg mL~(-1),遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常人血液中PSA的含量,具有在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。本工作首次提出了AA誘導(dǎo)Fe-MOFs發(fā)光增強(qiáng)現(xiàn)象,并通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)解釋了其作用機(jī)制。與游離的有機(jī)配體(BDC-NH_2)相比,由于配體與金屬離子間的電荷轉(zhuǎn)移(LMCT)和吸收猝滅作用,材料的發(fā)光性能明顯較弱。當(dāng)Fe-MOFs遇AA后,由于鐵離子的價(jià)態(tài)變化和LMCT的部分中斷致使BDC-NH_2熒光恢復(fù),實(shí)現(xiàn)熒光從弱到強(qiáng)。當(dāng)與AA反應(yīng)后,LMCT的UV-vis吸收峰消失以及Fe-MOFs的Fe 2p結(jié)合能降低,進(jìn)一步證實(shí)了之前的推測(cè)。綜上所述,本課題基于脲酶和Fe-MOFs開發(fā)了兩種應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的新型高分辨比色和多信號(hào)免疫分析法,在模擬生物醫(yī)學(xué)樣本的檢測(cè)中,實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高特異性的檢測(cè)結(jié)果。另外,上述基于酶聯(lián)免疫開發(fā)的檢測(cè)方法同樣適用于其他生物大分子或小分子的檢測(cè)。該類新型可視化免疫分析方法不僅具有良好的商業(yè)應(yīng)用前景,同時(shí)為生物檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的解決思路。
【圖文】：

高親和力和高特異性保證了免疫分析的高選擇性和高的靈敏度。免疫分析具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、易用性高，在不同的科學(xué)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，同時(shí)展示了越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)免疫分析信號(hào)的類型，免疫分析可分為電化學(xué)免疫分析、壓電免疫分析、磁學(xué)免疫分析和光學(xué)免疫分析。1.1.1 電化學(xué)免疫分析電化學(xué)免疫分析法是目前手持式免疫化學(xué)檢測(cè)中一種很有前途的方法。電化學(xué)免疫分析的原理如圖 1-1 所示[2]，它利用固定的識(shí)別探針選擇性地結(jié)合目標(biāo)物或分析物分子，溶液中探針捕獲目標(biāo)物，并通過(guò)檢測(cè)表面上局部的電信號(hào)變化來(lái)達(dá)到檢測(cè)的目的�；陔娀瘜W(xué)生物分析的工作原理，電化學(xué)分析方法是將化學(xué)信息轉(zhuǎn)換成可測(cè)量的電學(xué)信號(hào)，包括伏安信號(hào)、電位信號(hào)、電導(dǎo)信號(hào)或阻抗信號(hào)。與傳統(tǒng)的免疫分析方法相比，電化學(xué)免疫分析方法具有簡(jiǎn)單易行、攜帶方便、可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、實(shí)時(shí)、自動(dòng)化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療護(hù)理、環(huán)境檢測(cè)和食品安全的檢測(cè)中。電子器件的低成本和大規(guī)模生產(chǎn)是電化學(xué)方法更適合于高通量商業(yè)化分析的另一個(gè)原因。

圖 1-2 基于石墨烯納米片同時(shí)檢查癌胚抗原和甲胎蛋白的免疫電化學(xué)電化學(xué)免疫傳感原理圖[6].2 壓電免疫分析Sauerbrey 是第一個(gè)提出壓電效應(yīng)的人，并推導(dǎo)出公式（如圖 1-3 所示）證明了頻率化是由增加的質(zhì)量引起的[7]。在所有能夠測(cè)量表面質(zhì)量變化的物理傳感器中，壓電是一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的替代品。許多類型的材料（石英、電氣石、鈮酸鋰或鉭酸鋰、定化鋅或氮化鋁）都表現(xiàn)出壓電效應(yīng)，但石英的特性使其成為分析應(yīng)用中最常見(jiàn)的晶料。壓電免疫分析是采用石英晶體作為傳感器元件(石英晶體微天平)，在微重力模工作，具有成本效益高、檢測(cè)直接、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、輸出實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。在 20 世紀(jì) 90 年壓電分析方法被認(rèn)為不如其他類型的分析方法靈敏。然而，隨著壓電傳感器功能理完善和許多成功應(yīng)用的報(bào)道，這種情況發(fā)生了改變。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O657.3;R446.6

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