發(fā)布時(shí)間：2019-11-19 16:31

【摘要】：目的篩選能高效特異結(jié)合Akkermansia muciniphlia(A.muciniphlia)的核酸適配體,為后續(xù)利用適配子進(jìn)行A.muciniphlia的檢測和鑒定奠定基礎(chǔ)。方法合成83bp隨機(jī)ssDNA文庫,運(yùn)用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù),篩選A.muciniphlia的核酸適配體,并對其進(jìn)行序列測定、結(jié)構(gòu)分析、解離常數(shù)(KD值)測定及特異性驗(yàn)證。結(jié)果經(jīng)8輪篩選后,隨機(jī)ssDNA文庫的親和力從5.23上升56.99,篩選出的適配體富集庫經(jīng)克隆、測序后得到16條不同的核酸序列,根據(jù)同源性分成3個(gè)家族,最終篩選到2條對A.muciniphlia有較高親和力的高頻適配體,相應(yīng)的KD值分別為34.8nmol/L和12.8nmol/L(P0.05)。結(jié)論本文首次篩選出了對A.muciniphlia具有較高親和力和特異性的適配體,有望用于A.muciniphila的鑒定和檢測。
【圖文】：

坐標(biāo)，Origin軟件擬合解離曲線，，計(jì)算解離常數(shù)(KD值)。適配體的二級結(jié)構(gòu)采用ＲNAstructure軟件進(jìn)行預(yù)測。1.7克隆適配體親和特異性驗(yàn)證通過1.6解離常數(shù)的測定，選擇解離常數(shù)孝親和力強(qiáng)的適配體進(jìn)行特異性驗(yàn)證。具體如下:每個(gè)適配體取10pmol，分別與1.0×108cfu的目標(biāo)菌和反篩菌混合物(見表2)結(jié)合，測定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。重復(fù)試驗(yàn)3次，比較二者的熒光強(qiáng)度是否存在差異。其中反篩菌混合物為7種反篩菌分開培養(yǎng)后，各取1mL混合離心，用H2O通過麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整濃度后得到的菌懸液。2結(jié)果2.1PCＲ擴(kuò)增的最優(yōu)循環(huán)數(shù)由圖1可見，第11～13個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物均為略小于100bp的單一條帶，與隨機(jī)ssDNA文庫總長度為83bp的目的片段接近，因此符合預(yù)期結(jié)果。但是從第14個(gè)循環(huán)開始至第18個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生的條帶逐漸偏離目標(biāo)片段83bp的位置，并出現(xiàn)多個(gè)略大于100bp條帶的非特異性擴(kuò)增條帶，其擴(kuò)增效果不理想。另外由于第13個(gè)循環(huán)的條帶最亮，其PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物量最多，因此該輪篩選后PCＲ擴(kuò)增的最優(yōu)循環(huán)數(shù)為13。研究顯示，其他輪次篩選后PCＲ的最優(yōu)循環(huán)數(shù)見表1，其擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果與圖1類似，不再逐一列出。表1SELEX過程中各輪篩選后PCＲ的最優(yōu)循環(huán)數(shù)篩選輪數(shù)23456789101112最優(yōu)循環(huán)數(shù)14131512152119181414132.2SELEX篩選過程中親和力變化如表2、圖2所示，隨著SELEX篩選的進(jìn)行，ssDNA富集庫與A.muciniphlia的親和力逐漸增加，第8輪時(shí)達(dá)到頂峰，與第3輪相比，親和力提高了10.9倍(56.99/5.23)。第8輪之后，隨著反篩壓力的施加，ssDNA富集庫與A.muciniphlia的親和力不斷降低，因此選擇第8輪ssDNA富集庫進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。圖1第3輪篩選后優(yōu)化PCＲ的瓊脂糖凝膠電泳圖注:圖中11－18代表PCＲ擴(kuò)增至第11個(gè)循環(huán)～第18個(gè)循環(huán)時(shí)所獲得的產(chǎn)物電泳條帶表2SE

脂糖凝膠電泳圖注:圖中11－18代表PCＲ擴(kuò)增至第11個(gè)循環(huán)～第18個(gè)循環(huán)時(shí)所獲得的產(chǎn)物電泳條帶表2SELEX篩選過程中反篩情況及結(jié)合率測定結(jié)果輪數(shù)反篩菌F1F0結(jié)合率(%)3無2.234614.23905.235無2.124312.07065.876金黃色葡萄球菌－－－7蠟樣芽孢桿菌1.11666.42555.798沙門菌18.833011.014656.999志賀菌27.830725.699136.1010大腸埃希菌12.797635.025912.1811水弧菌9.843035.10289.3512溶血性鏈球菌5.520926.35186.98注:F1為篩選后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為篩選前的熒光強(qiáng)度，結(jié)合率=(F1/3F0)%圖2ssDNA文庫與A.Muciniphila的親和力變化·3210·現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)2017年第44卷第17期ModernPreventiveMedicine，2017，Vol.44，NO.17

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本文編號：2563150