本文關鍵詞：TLR4通過介導CX3CR1內吞促進膿毒癥免疫崩潰的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:膿毒癥是臨床上亟待解決的難題,免疫崩潰是此類患者死亡的重要原因。闡明膿毒癥免疫崩潰的機制有助于尋找新的臨床策略以改善預后。文獻報道,TLR4與膿毒癥免疫反應密切相關,并且Toll樣受體和趨化因子受體之間的交互作用,在機體免疫功能和炎癥反應中發(fā)揮重要作用。本課題擬應用體內外膿毒癥模型、“二次打擊”動物模型、免疫耐受細胞模型,采用免疫共聚焦、q PCR等實驗技術,以明確Toll樣受體4(TLR4)以及其與趨化因子受體CX3CR1的交互作用在膿毒癥免疫抑制期的作用以及機制。本課題的完成,有可能發(fā)現(xiàn)膿毒癥的新機制,為臨床治療提供新的靶點。方法:分三部分:第一部分為探索CLP后免疫崩潰期以及“二次打擊”模型后小鼠情況:(1)取25%結扎CLP模型,C57BL/6小鼠40只隨機分成4組各10只,分別于0,1,4,7d眼球取血ELISA檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,提取肺臟組織m RNA逆轉錄進行q PCR檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平,肺臟組織HE染色,肺臟研磨提取蛋白western blot檢測P-NFκB P65。(2)采取盲腸結扎穿孔(CLP)后肺炎鏈球菌“二次打擊”模型,結扎盲腸遠端25%,取40只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組(n=10),CLP 1d后“二次打擊”組(n=10),CLP 4d后“二次打擊”組(n=10),CLP 7d后“二次打擊”組(n=10),觀察小鼠“二次打擊”后7天生存率。第二部分為研究TLR4對膿毒癥免疫崩潰作用并探索發(fā)揮作用的可能途徑:(1)取野生型(WT)小鼠(即C57BL/6小鼠)10只,TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠10只,采取25%CLP 4d后肺炎鏈球菌“二次打擊”模型,觀察其“二次打擊”后7天生存率。(2)采取25%結扎CLP模型,C57BL/6小鼠與TLR4-/-小鼠各40只隨機分成4組各10只,分別于0,1,4,7d取腹腔巨噬細胞,共聚焦顯微鏡技術觀察CX3CR1內吞情況。第三部分為研究CX3CR1內吞促進免疫崩潰的可能機制:使用細胞系RAW264.7細胞,si RNA干擾CX3CR1、氯丙嗪抑制網(wǎng)格蛋白、si RNA干擾β-arrestin,并構建免疫耐受細胞模型,于LPS二次處理后第3h分別收集上清液ELISA檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TP-NFα的濃度。結果:1.El ISA結果顯示,C LP造模第4d小鼠血清IL-1β、TNFα、IL-6濃度較之CLP造模第1d、7d顯著降低(P0.05);q PCR結果提示CLP造模第4d肺臟組織中IL-1β、TNFα、IL-6基因表達水平較之CLP造模第1d、7d降低(P0.05);病理切片HE染色結果提示CLP造模第1d小鼠肺臟組織炎癥細胞浸潤較明顯,肺泡結構破壞嚴重,之后逐漸緩解;Western Blot結果提示CLP造模第1d小鼠肺臟組織P-NFκB P65蛋白表達水平最高,之后逐漸降低;CLP造模第4d鼻腔給予肺炎球菌懸液的膿毒癥小鼠,生存率最低為40%,第1d、第7d給予肺炎球菌懸液小鼠生存率分別為60%、80%。2.較之野生型(WT)小鼠,TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠CLP造模第4d鼻腔給予肺炎球菌懸液的膿毒癥小鼠,生存率明顯增加;WT小鼠CLP造模后第4d取腹腔巨噬細胞免疫共聚焦顯微鏡下可見CX3CR1明顯內吞,TLR4-/-小鼠腹腔巨噬細胞未見CX3CR1內吞。3.較之未處理RAW264.7細胞,si RNA干擾CX3CR1處理的RAW264.7細胞建立免疫耐受細胞模型后LPS二次處理3h的上清液細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度顯著增加(P0.05);較之未處理RAW264.7細胞,氯丙嗪處理的RAW264.7細胞建立免疫耐受細胞模型后LPS二次處理3h的上清液細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度顯著增加(P0.05);較之未處理RAW264.7細胞,si RNA干擾β-arrestin處理的RAW264.7細胞建立免疫耐受細胞模型后LPS二次處理3h的上清液細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度顯著增加(P0.05)。結論:1.小鼠膿毒癥CLP模型后第4d為免疫崩潰期,并且免疫崩潰期二次感染的生存率低;2.TLR4基因敲除可增加免疫崩潰期二次感染生存率,可能原因是TLR4通過介導CX3CR1內吞途徑促進免疫崩潰。3.TLR4通過誘導網(wǎng)格蛋白內吞途徑實現(xiàn)CX3C R1內吞,并通過內吞組分β-arrestin促進免疫崩潰。
【關鍵詞】：TLR4 CX3CR1 內吞 膿毒癥 免疫崩潰
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 緒論12-16
• 材料和方法16-27
• 1 材料16-17
• 1.1 試劑16
• 1.2 實驗耗材16-17
• 1.3 儀器17
• 2 方法17-27
• 2.1 研究對象17-18
• 2.2 實驗分組18-19
• 2.3 小鼠CLP及“二次打擊”模型制備[31]19
• 2.4 小鼠腹腔巨噬細胞分離和培養(yǎng)19-20
• 2.5 RAW264.7 細胞培養(yǎng)20-21
• 2.6 免疫耐受細胞模型21
• 2.7 石蠟切片HE染色21-22
• 2.8 Western Blot22-23
• 2.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗23-24
• 2.10 細胞干擾24
• 2.11 細胞免疫共聚焦24-25
• 2.12 抽提細胞總RNA以及Real- Time PCR25
• 2.13 PCR引物序列25-26
• 2.14 統(tǒng)計學方法26-27
• 結果27-31
• 1 探索CLP后免疫崩潰期以及“二次打擊”模型后小鼠情況27-28
• 2 研究TLR4對膿毒癥免疫崩潰作用并探索發(fā)揮作用的可能途徑28-29
• 3 研究CX3CR1內吞促進免疫崩潰的可能機制29-31
• 討論31-33
• 結論33-34
• 參考文獻34-38
• 綜述38-48
• 參考文獻44-48
• 致謝48-49
• 碩士期間發(fā)表文章49

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本文編號：253254