【摘要】：凝血酶是一種重要的多功能蛋白酶,催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白,促進(jìn)凝血,濃度變化異常會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生如血栓、彌散性小管內(nèi)凝血(DIC)等。傳統(tǒng)的凝血酶檢測方法技術(shù)復(fù)雜,時間長,不能滿足臨床的檢測要求,因此快速、有效地檢測凝血酶對臨床診斷非常重要。近年來作為分子生物學(xué)研究工具的生物傳感器對凝血酶的檢測已有報道,但一些檢測方法的靈敏性有待進(jìn)一步提高,本研究基于石墨烯氧化物(GO)-DNA傳感器發(fā)展了幾種高靈敏的檢測方法,所用的DNA序列是與凝血酶特異性結(jié)合的核酸適配體。1.采用聚乙二醇(PEG)修飾的GO-DNA傳感器對凝血酶高靈敏檢測。GO為熒光淬滅劑,FAM修飾的核酸適配體為識別元件,用PEG對裸露的GO進(jìn)行表面修飾,去除對凝血酶的非特異性吸附,通過優(yōu)化PEG的濃度提高檢測靈敏性,檢測限為4.8 pM,與裸露的GO表面凝血酶檢測限51 pM相比提高了10倍。2.結(jié)合金納米(GNPs)的GO-DNA傳感器對凝血酶高靈敏檢測。吐溫80(tween 80)加快GNPs與巰基修飾核酸適配體的連接速度,還阻止GO表面對蛋白質(zhì)的非特異性吸附,提高檢測靈敏性,基于該特點發(fā)展了一種基于GNPs紫外吸收值與顏色變化為參考的GO傳感器,通過比較加入蛋白前后溶液中組分、吸收值、溶液顏色的變化,計算凝血酶的含量,該方法無需熒光標(biāo)記、簡單、快速,檢測限為0.68 pM。3.基于共價連接的GO-DNA傳感器對凝血酶高靈敏檢測。將FAM修飾的氨基化的核酸適配體共價連接到活化的GO表面,并去除物理吸附的核酸適配體,避免假陽性信號;另一方面PEG阻止GO表面的非特異性吸附,從而提高凝血酶檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性,檢測極限為0.034 pM。4.基于酶切循環(huán)放大的GO-DNA傳感器對凝血酶高靈敏檢測。熒光修飾的凝血酶核酸適配體(TBA)與互補(bǔ)核酸序列capture-DNA雜交,固定在GO表面,在核酸外切酶的催化下,凝血酶循環(huán)使用,TBA核酸適配體-凝血酶復(fù)合物不斷形成,熒光信號逐漸放大,實現(xiàn)凝血酶的高靈敏檢測,該方法對凝血酶的檢測限為0.024 pM。
[Abstract]:Thrombin is an important multifunctional protease, which catalyzes the conversion of fibrin to fibrin and promotes coagulation. Abnormal concentration changes will lead to the occurrence of some diseases, such as thrombus, disseminated tubule coagulation (DIC) and so on. The traditional detection method of thrombin is complex, long time and can not meet the requirements of clinical detection, so rapid and effective detection of thrombin is very important for clinical diagnosis. In recent years, biosensors, as a tool for molecular biology research, have been reported for the detection of thrombin, but the sensitivity of some detection methods needs to be further improved. In this study, several highly sensitive detection methods were developed based on graphene oxide (GO)-DNA sensor. The DNA sequence used is a nucleic acid aptamer that specifically binds to thrombin. Polyethylene glycol (PEG) modified GO-DNA sensor was used for highly sensitive detection of thrombin. Go was used as fluorescent quenching agent, FAM modified nucleic acid aptamer was used as recognition element, and bare GO was modified by PEG. By optimizing the concentration of PEG to improve the detection sensitivity, the detection limit of 4.8 pM, was 10 times higher than that of 51 pM on the surface of exposed GO. The GO-DNA sensor of alloyed nano-(GNPs) is highly sensitive to the detection of thrombin. Tween 80 (tween 80) accelerates the bonding speed between GNPs and sulfhydryl modified nucleic acid aptamers, prevents the nonspecific adsorption of proteins on the surface of GO, and improves the sensitivity of detection. Based on this characteristic, a GO sensor based on GNPs UV absorption value and color change is developed. By comparing the changes of composition, absorption value and solution color before and after adding protein, the content of thrombin is calculated. The method is simple and rapid without fluorescence labeling, and the detection limit is 0.68 pM.3.. GO-DNA sensor based on covalent connection is highly sensitive to thrombin detection. The amino acid aptamers modified by FAM were covalently connected to the activated GO surface and the physically adsorbed aptamers were removed to avoid false positive signals. On the other hand, PEG prevents the nonspecific adsorption of GO surface, thus improving the accuracy and sensitivity of thrombin detection, and the detection limit is 0.034 pM.4.. The GO-DNA sensor based on enzyme digestion cycle amplification is highly sensitive to the detection of thrombin. The fluorescent modified thrombin nucleic acid aptamer (TBA) was crossbred with complementary nucleic acid sequence capture-DNA and fixed on the surface of GO. Under the catalysis of exonuclease, thrombin was recycled and the TBA nucleic acid aptamer-thrombin complex was continuously formed. The fluorescence signal was gradually amplified to realize the highly sensitive detection of thrombin. The detection limit of this method was 0.024 pM..
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O613.71;R446.1

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本文編號：2482989