發(fā)布時(shí)間：2019-05-07 06:17

【摘要】：疾病的早期診斷是目前臨床醫(yī)學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一,發(fā)展靈敏度高、簡單快速以及便攜的生物診斷新方法尤為重要。近年來,DNA納米技術(shù)和無機(jī)納米材料的快速發(fā)展,為發(fā)展新型的生物診斷方法提供了新的思路。SERS光譜具有峰窄、靈敏度高、抗光漂白、不受生物樣本自發(fā)熒光干擾以及能夠快速實(shí)時(shí)原位檢測的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于生物分析和成像中。電化學(xué)檢測具有靈敏度高、快速、廉價(jià)以及易于集成等特點(diǎn)也得到生物傳感器的青睞。本文就結(jié)合生物納米材料和SERS以及電化學(xué)檢測手段主要做了以下四個(gè)方面的工作。1.“即用型”多色金-銀納米蘑菇SERS探針用于超靈敏和多元的核酸檢測合成具有強(qiáng)而穩(wěn)定的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)信號的含銀金屬納米結(jié)構(gòu)對于開發(fā)用于生物檢測的超靈敏探針具有很大的前景。然而,直接合成“即用型”納米探針仍然是非常具有挑戰(zhàn)性的。在這里我們合成了DNA介導(dǎo)的含有納米空隙的金銀納米蘑菇,并將之用于多種DNA和RNA的同時(shí)檢測。納米結(jié)構(gòu)中的DNA不僅可以作為間隙DNA(介導(dǎo)的DNA),而且可以作為探針DNA(雜交DNA),并且具有識別DNA和RNA靶標(biāo)的能力。重要的是,我們建立了生成多色SERS探針的兩種不同策略。第一,將拉曼分子標(biāo)記的巰基DNA組裝在金納米顆粒上;第二將拉曼分子與探針DNA共同組裝在金納米顆粒上。這種“即用型”SERS探針也為開發(fā)各種生物分子的超靈敏檢測方法提供了巨大的潛力。2.多元甲基化特異的酶連核苷酸分析(MS-ELONA)方法用于DNA甲基化的定量研究癌癥相關(guān)基因啟動子甲基化的變化在致癌過程中起著重要作用,DNA甲基化具有早期癌癥診斷的潛力。我們構(gòu)建了MS-ELONA方法用于DNA甲基化的多元和高靈敏度檢測。首先用甲基化特異的引物去擴(kuò)增亞硫酸氫鹽處理的DNA,然后將PCR產(chǎn)物固定在絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)上。在超過10萬倍的未甲基化等位基因存在的情況下,我們可以檢測到2 pg的甲基化DNA。我們還通過用去甲基化藥物處理癌細(xì)胞來檢測藥物對DNA甲基化的可逆修飾,并能夠用于篩選抗腫瘤藥物以及可用作腫瘤標(biāo)志物的甲基化DNA。結(jié)合自主研發(fā)的16通道電化學(xué)工作站以及16通道絲網(wǎng)印刷電極,我們的研究提供了一種簡單,便宜和多元的平臺用來量化特定基因的甲基化水平,并有潛力應(yīng)用于臨床研究中。3.基于智能手機(jī)的電化學(xué)生物傳感器用于血清中外泌體即時(shí)檢測以及監(jiān)測外泌體的分泌外泌體是由哺乳動物細(xì)胞主動分泌的納米級囊泡,其攜帶者親代細(xì)胞的遺傳信息,在細(xì)胞間通訊起著重要作用。外泌體也可以作為潛在的生物標(biāo)志物,可用于癌癥診斷和術(shù)后預(yù)測。在這里,我們結(jié)合智能手機(jī)開發(fā)了一種超靈敏和便攜式電化學(xué)方法定量分析外泌體。利用基于聚合物HRP的信號放大,只需要5μL樣本,我們就可以在2小時(shí)內(nèi)檢測到7.23 ng外泌體。我們還可以直接捕獲5μL血清中的外泌體和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。利用CD63陽性外泌體檢測系統(tǒng),我們的研究發(fā)現(xiàn)CD63在前列腺患者血清中外泌體的表達(dá)較少,對前列腺癌的診斷具有廣闊的應(yīng)用潛力。此平臺也可以用于監(jiān)測藥物治療后癌細(xì)胞外泌體的分泌,并有潛力用于現(xiàn)場測定。4.基于DNA四面體的碳基電化學(xué)傳感檢測平臺與多種類分子診斷近年來隨著納米科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展,納米材料修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極由于具有制備簡單,價(jià)格低廉,容易集成等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域中,在環(huán)境,衛(wèi)生,食品,診斷等領(lǐng)域中展現(xiàn)了其廣闊的應(yīng)用前景,因此構(gòu)建基于絲網(wǎng)印刷碳電極的簡易且通用的電化學(xué)檢測平臺尤為重要。目前由于絲網(wǎng)印刷碳電極具有較為粗糙的表面,易產(chǎn)生非特異性吸附,以及探針方向不可控等缺陷,基于絲網(wǎng)印刷碳電極的核酸檢測平臺的研究較少,這極大的限制了其在核酸研究中的應(yīng)用。本文首次報(bào)道了利用DNA四面體修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極通用平臺,其可以解決碳界面的缺陷,并且能夠應(yīng)用于多種生物活性分子的檢測。通過簡單的共價(jià)偶聯(lián)就能將DNA四面體固定在碳界面上,制作工藝簡單,通過改變DNA四面體延伸出來的探針序列就可以用于不同的靶標(biāo)分析中。在這里我們設(shè)計(jì)了gap雜交,“三明治夾心”以及核酸適配體遞減策略分別用于mi RNA141,凝血酶以及ATP的檢測,具有較高的信噪比以及檢測靈敏度和特異性。此外,DNA四面體絲網(wǎng)印刷碳電極通用檢測平臺能夠成功應(yīng)用于血清樣本中。因此,具有高信噪比的DNA四面體通用碳納米生物傳感界面極大的拓展了其在核酸研究中的應(yīng)用并且具有應(yīng)用于臨床疾病診斷的潛力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(上海應(yīng)用物理研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446;TB383.1

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9 楊U，

本文編號：2470834