本文選題：Nedd4　切入點：非經典炎癥小體　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年碩士論文

【摘要】：膿毒癥是臨床常見的全身性炎癥反應綜合癥,感染、創(chuàng)傷、燒傷、休克等均是其誘因,且死亡率高,是臨床常見的并發(fā)癥之一。研究表明,膿毒癥早期機體會產生過度、過多的促炎因子,雖然促炎反應有利于清除病原菌,但過度的炎癥反應會導致細胞過度焦亡,增加機體的免疫損傷。炎癥小體在炎癥反應中具有重要作用,它是由模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)檢測病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)后,直接或者通過ASC接頭蛋白同Pro-Caspase-1蛋白形成的復合物,隨即使Caspase-1活化,剪切Pro-IL-1β和Pro-IL-18,并釋放IL-1β和IL-18,這也稱為經典炎癥小體。2011年Kayagaki研究發(fā)現(xiàn)Caspase-11是小鼠革蘭氏陰性菌膿毒癥死亡的主要原因,并由此提出了非經典炎癥小體。非經典炎癥小體以Caspase-11為核心,Caspase-11作為胞內模式識別受體識別胞內革蘭氏陰性菌細胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),與LPS結合后發(fā)生寡聚化而活化,繼而使細胞發(fā)生炎性焦亡,以抵御革蘭氏陰性菌感染,但是非經典炎癥小體的調控機制一旦失調,則可能會引起非經典炎癥小體的過度激活,最終導致膿毒癥死亡,所以亟需對非經典炎癥小體的調控機制進行研究。研究發(fā)現(xiàn),泛素化在經典炎癥小體中具有重要的調控作用,ASC的線性泛素化是NLRP3經典炎癥小體激活所必須的,泛素化編輯酶A20亦可通過阻斷NF-κB通路下調NLRP3、Pro-IL-1β和Pro-IL18的表達,從而負調控NLRP3經典炎癥小體。我們實驗室成員在國外博士后研究期間發(fā)現(xiàn)E3泛素化連接酶Cbl-b通過泛素化修飾NLRP3蛋白負調控炎癥小體的激活,但是到目前為止關于泛素化對非經典炎癥小體的調控作用仍未見報道。Nedd4是一種重要的HECT型E3泛素連接酶,在多種細胞中表達,且具有多種底物分子,參與著眾多生理過程,研究發(fā)現(xiàn),Nedd4可通過泛素化Cbl-b促進Th細胞活化,在B細胞中Nedd4可通過對TRAF3 K63形式的泛素化調節(jié)CD40介導的AKT通路,參與著免疫球蛋白類型的轉換。說明Nedd4在獲得性免疫的調控中具有重要作用,但是在天然免疫中的作用,尤其是對非經典炎癥小體的調控作用及機制需進一步探討,因此本研究將探討Nedd4對非經典炎癥小體的調控作用及機制,為以后干預由革蘭氏陰性菌所引起的膿毒癥提供理論依據。第一部分 Nedd4對非經典炎癥小體調控作用的研究本部分研究旨在探討Nedd4對非經典炎癥小體的調控作用。首先利用Nedd4+/-小鼠在小鼠水平探討Nedd4對非經典炎癥小體的調控作用。利用低劑量LPS(400ng/kg)腹腔注射Nedd4+/-和野生型小鼠進行引發(fā)(Priming)7小時,然后使用高劑量LPS(10mg/kg)刺激小鼠(activation),建立非經典炎癥小體激活模型,觀察小鼠24小時內存活率,檢測血清中IL-1β含量,HE染色觀察臟器炎性損傷。隨后在細胞水平探討Nedd4對非經典炎癥小體的調控作用。利用CRISPR/Cas9技術建立Nedd4敲除的BMDM細胞系。使用LPS(500ng/ml)引發(fā)Nedd4敲除及其對照細胞4小時,然后按照1×106/ug LPS進行電轉,建立非經典炎癥小體激活模型,2.5小時后收集細胞培養(yǎng)上清,檢測LDH釋放。此外使用LPS(500ng/ml)引發(fā)Nedd4敲除及其對照細胞7小時,將LPS濃度調整為2ug/ml同時使用8(16)ug/ml CTB介導LPS進入細胞內部,16小時后收集細胞培養(yǎng)上清檢測LDH釋放,對電轉實驗結果進行驗證。結果表明,相對于野生型小鼠,Nedd4+/-小鼠生存率顯著降低,血清中IL-1β含量顯著升高,心肝具有較嚴重的炎性損傷;細胞實驗結果顯示,相對于對照組,Nedd4敲除后細胞死亡率顯著升高,且呈現(xiàn)CTB劑量依賴效應。本部分實驗結果提示,Nedd4對非經典炎癥小體具有抑制作用,這為下一步研究調控的分子機制奠定了基礎。第二部分 Nedd4對非經典炎癥小體調控作用的機制研究本部分研究在第一部分研究結果的基礎上,以非經典炎癥小體的核心分子Caspase-11為切入點,在m RNA水平和蛋白水平初步探討Nedd4調控非經典炎癥小體的分子機制,一、Nedd4對Caspase-11蛋白m RNA水平調控的研究本章節(jié)探究Nedd4對Caspase-11蛋白m RNA水平調控作用,通過序列分析,Caspase-11的上游分子p38αVariant2具有Nedd4所特異性識別的結構域,推測p38α可能為Nedd4的底物分子,Nedd4通過調控p38MAPK通路調控Caspase-11 m RNA水平。首先利用Real-time PCR的方法探討Nedd4對Caspase-11 m RNA的調控作用,然后利用LPS刺激Nedd4穩(wěn)定敲低(敲除)及其對照細胞,293T細胞共轉,MG132和氯喹阻斷等實驗手段,通過ELISA、雙熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blot技術、免疫共沉淀、Ni-NTA純化、質譜分析等方法進一步進行研究。與對照組相比,Nedd4穩(wěn)定敲低(敲除)組Caspase-11的m RNA水平顯著升高;TNF-α的分泌顯著增加;p-p38(p38)的蛋白水平顯著升高;雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)Nedd4抑制轉錄因子AP-1活性;p-p38(p38)蛋白經泛素化由蛋白酶體和溶酶體途徑進行降解;Co-IP實驗結果顯示,磷酸化影響Nedd4與p38αV1的相互作用,但對Nedd4與p38αV2的相互作用沒有影響;泛素化實驗結果表明,Nedd4參與著p38αK48和K63兩種形式的泛素化,磷酸化顯著增強Nedd4對p38αV1/2的K48形式的泛素化;質譜分析發(fā)現(xiàn),p38αV1在K45、K53(K54)和K152位點具有泛素化修飾,p38αV2的K53(K54)、K287和K295位點具有泛素化修飾,K53(K54)位點是共有的泛素化位點。該實驗結果提示:Nedd4可通過對p38α直接泛素化使其進行降解,起到對p38MAPK通路的負調控作用,從而實現(xiàn)對Caspase-11 m RNA的負調控。二、Nedd4對Caspase-11蛋白水平調控的研究本章主要研究Nedd4在蛋白水平對Caspase-11的調控作用,并初步探討其分子機制。如第一章所述方法,使用LPS刺激、293T細胞共轉,mg132和氯喹阻斷等實驗手段,通過Real-time PCR、Western blot技術、免疫共沉淀、Ni-NTA純化等檢測方法進行探討。與對照組相比,Nedd4穩(wěn)定敲低(敲除)組的Caspase-11蛋白水平顯著升高;Caspase-11蛋白經泛素化由蛋白酶體途徑進行降解;Co-IP實驗發(fā)現(xiàn),Nedd4可與Caspase-11蛋白發(fā)生直接的相互作用;泛素化實驗表明,Nedd4對Caspase-11蛋白具有直接的泛素化作用。該結果提示Nedd4可通過與Caspase-11蛋白的直接相互作用對其進行泛素化,使其進入蛋白酶體進行降解,說明Nedd4可直接在蛋白水平調控Caspase-11。綜上所述:本研究通過一系列實驗探討Nedd4對非經典炎癥小體的調控作用,并對其調控機制進行初步研究。結果表明,Nedd4對非經典炎癥小體具有負調控作用。Nedd4可通過負調控p38αMAPK通路實現(xiàn)對非經典炎癥小體的核心分子Caspase-11 m RNA水平的調控作用,同時Nedd4可直接泛素化Caspase-11使其進行降解,從而實現(xiàn)對Caspase-11蛋白水平的調控。Nedd4在m RNA水平和蛋白水平對Caspase-11蛋白進行調控,從而實現(xiàn)對非經典炎癥小體的調控,這為后期臨床干預革蘭氏陰性菌膿毒癥奠定了理論基礎。
[Abstract]:In 2011 , it was found that the expression of Caspase - 11 was the main cause of death of Gram - negative bacteria in mice . The effects of Nedd4 on the control of non - classical inflammatory small bodies were investigated . The results showed that Nedd4 had an important role in the regulation of non - classical inflammatory small bodies . The effects of Nedd4 on the expression of Caspase - 11 mRNA were investigated by means of real - time PCR . The results showed that Nedd4 was involved in the regulation of p38 偽V1 / 2 . The results showed that Nedd4 was involved in the regulation of p38MAPK . The results showed that Nedd4 was involved in the regulation of p38MAPK pathway . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7
，

本文編號：1729098