本文關鍵詞： 中性粒細胞亞群 CXCR4 老年膿毒癥 Treg細胞 歸巢效應　出處：《大連醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：膿毒癥(sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應,尤其老年人免疫功能發(fā)生變化,對膿毒癥的易感性增加,罹患相對危險是年輕者的13.1倍。老齡膿毒癥患者可進一步發(fā)展為嚴重膿毒癥及膿毒性休克。嚴重膿毒癥病情進展快,預后差,是臨床危重患者最主要的死亡原因之一。盡管目前抗生素治療和外科技術等有了很大地提升,膿毒癥病死率仍然很高。已知膿毒癥是多種細胞和介質(zhì)參與的復雜反應。越來越多的研究證明中性粒細胞參與了膿毒癥的炎癥反應并在其中起協(xié)同作用。中性粒細胞是先天免疫系統(tǒng)的最關鍵效應細胞,在宿主對感染的第一道防線中起到至關重要的作用。中性粒細胞具有廣泛的防御感染入侵的功能。之前的研究表明,巨噬細胞和樹突狀細胞等各類免疫細胞可以分化成不同功能的表型。最近有研究指出,循環(huán)中存在相似的不同功能表型的中性粒細胞。他們基于CD16(FcγRIII受體)和CD62L(L-選擇蛋白)表達的不同分為不同的中性粒細胞亞群。除成熟中性粒細胞(CD16~(high) CD62Lhigh)外,還有兩個不同的中性粒細胞亞群:未成熟中性粒細胞(CD16low CD62Lhigh)和抑制中性粒細胞(CD16~(high) CD62~(Llow))。未成熟的中性粒細胞可能在成熟中性粒細胞從骨髓中消耗之后出現(xiàn),并在抗微生物免疫功能中被認為是無效的細胞類型。抑制中性粒細胞被認為能夠抑制T細胞增殖,并在減輕嚴重炎癥反應中起重要作用。然而,中性粒細胞如何在感染后迅速到達感染灶中呢?趨化因子在其中發(fā)揮著巨大作用。趨化因子是一類相對分子質(zhì)量為8000~15000的小分子炎性細胞因子,通過與細胞表面的相關受體結合,在炎性細胞活化和遷移過程中發(fā)揮重要作用。SDF-1是由骨髓基質(zhì)細胞持續(xù)分泌的一種炎性趨化因子,也是唯一能與趨化因子受體CXCR4結合并激活的天然趨化因子。SDF-1與CXCR4廣泛地表達于多種細胞和組織中,并在細胞的動員、遷移、增殖和存活中起著至關重要的作用�；隗w內(nèi)中性粒細胞活化在炎癥環(huán)境中的存在,我們通過研究中性粒細胞不同亞群的功能,探討抑制性中性粒細胞亞群在老齡膿毒癥患者免疫抑制中的作用機制,為老齡膿毒癥的研究提供新的研究靶點。本課題擬采用臨床老年膿毒癥患者血液樣本和老齡膿毒癥小鼠各個組織器官樣本闡述不同中性粒細胞亞群的不同分化功能,研究CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群和CXCR4與膿毒癥患者預后的相關性,以及CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群通過CXCR4在老齡膿毒癥患者免疫抑制中對Treg細胞調(diào)控的機制。最后從中性粒細胞亞群的穩(wěn)態(tài)、釋放以及回巢各個角度探討調(diào)控CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow CXCR4high中性粒細胞對22月齡的老齡膿毒癥小鼠各個器官的保護作用,為臨床診斷、治療膿毒癥提供新的靶點和思路。實驗方法第一部分l.通過梯度離心法分選老年健康志愿者外周血中性粒細胞,并通過免疫熒光和流式細胞術對其進行鑒定。2.LPS刺激膿毒癥患者和老年健康志愿者外周血中性粒細胞后,通過流式細胞術檢測中性粒細胞表型的變化規(guī)律。3.分析老年膿毒癥患者外周血CD15~+CD16~+亞群比例分配。4.分析老年膿毒癥患者外周血中性粒細胞各亞群中CD11b和CD64的表達情況。5.CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群和CXCR4與老年膿毒癥患者預后相關性。第二部分l.通過流式細胞分選方法,分選出老年膿毒癥患者CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群,以不同比例與健康老年志愿者外周血單個核細胞共培養(yǎng),分析其對不同T淋巴細胞增殖的抑制效應。2.通過ELISA法檢測IFN-γ和IL-6細胞因子表達水平。3.老年膿毒癥患者CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群與健康老年志愿者外周血單個核細胞共培養(yǎng)后,用流式細胞術方法分析其對不同亞群Treg細胞的調(diào)控作用。4.通過流式細胞術方法分析不同抑制劑處理后CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群對T淋巴細胞增殖的抑制效應。第三部分1.通過流式細胞術方法分析老齡膿毒癥小鼠外周血中性粒細胞亞群的功能以及Gr-1~+Ly6Clow CD11bhigh CD62~(Llow)隨著老齡重癥膿毒癥小鼠病情變化的表達情況。2.通過流式細胞術方法檢測老齡小鼠在建立膿毒癥模型前后血、骨髓、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟中抑制性中性粒細胞亞群含量的變化。3.通過流式細胞術方法分析阻斷CXCR4后,老齡膿毒癥小鼠血、骨髓、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟中抑制性中性粒細胞亞群與未處理組比較的差異。4.探討阻斷CXCR4和氧化應激后對老齡重癥膿毒癥小鼠7天生存率的影響。結果第一部分1.老年膿毒癥患者早期外周血抑制性中性粒細胞亞群CD16~(high)CD62~(Llow)和未成熟中性粒細胞亞群CD16low CD62Lhigh比例明顯高于老年健康志愿者,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而CD16~(high) CD62Lhigh和CD16low CD62~(Llow)表達組間無顯著差異。2.LPS刺激老年健康志愿者中性粒細胞,CD16~(high) CD62~(Llow)和CD16low CD62Lhigh比例比未刺激組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而CD16~(high) CD62Lhigh表達無組間顯著差異。3.分析老年膿毒癥患者外周血CD16~+亞群比例,CD16hig h CD62Lhigh亞群占CD16~+亞群比例最少;CD16~(high) CD62~(Llow)亞群,CD16low CD62~(Llow)亞群、CD16low CD62Lneg亞群和CD16~(high) CD62Lneg亞群占CD16~+亞群比例較高,其中CD62Lneg所占比列最高,組內(nèi)差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4.老年膿毒癥患者全血中性粒細胞CD16~+亞群中CD11b和CD64的表達情況顯示:CD16~(high) CD62~(Llow)亞群CD11b和CD64表達比例最高。5.CD16low CD62Lhigh亞群和CD16~(high) CD62~(Llow)亞群與APACHEⅡ評分成正相關,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。。6.老年膿毒癥死亡組APACHEⅡ評分,血乳酸值和CD16~(high) CD62~(Llow) CXCR4high亞群的比例均高于老年膿毒癥存活組,膿毒癥休克組APACHEⅡ評分和血乳酸值均高于膿毒癥組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。CD16~(high) CD62~(Llow) CXCR4high亞群表達與死亡率成正相關,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。第二部分1.將老年膿毒癥患者不同比例的CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群與健康老年志愿者外周血單個核細胞共培養(yǎng),均產(chǎn)生劑量依賴性的抑制T淋巴細胞增殖的效應,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.以2:1比例混合培養(yǎng)CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群與健康老年志愿者外周血單個核細胞后,IFN-γ和IL-6表達水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.以2:1比例混合培養(yǎng)CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群與健康老齡志愿者外周血單個核細胞后,Treg細胞的表達增加,效應Treg細胞亞群表達增加和幼稚Treg亞群表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4.CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群通過CXCR4和氧化應激介導對T淋巴細胞調(diào)控效應。第三部分1.隨著老齡膿毒癥小鼠病程的延長,Gr-1~+Ly6Clow CD11bhigh CD62~(Llow)與Gr-1~+Ly6Chigh CD11blow CD62Lhigh比例逐漸增加。隨著老齡膿毒癥小鼠病情不斷嚴重,CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow CXCR4high表達逐漸增強,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.與健康老齡小鼠相比,內(nèi)毒素血癥引起小鼠血液、肝臟、肺和腎臟中積累的抑制性嗜中性粒細胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量顯著升高,反而骨髓中抑制性嗜中性粒細胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。當阻斷CXCR4信號后,與內(nèi)毒素血癥小鼠相比,阻斷后引起小鼠血液、肝臟、肺和腎臟中積累的抑制性嗜中性粒細胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量顯著降低,而骨髓中抑制性嗜中性粒細胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量明顯增加,差異有統(tǒng)計學差異(p0.05)。3.阻斷CXCR4和氧化應激信號后可以明顯提高重度膿毒癥小鼠7天內(nèi)的生存率。結論1.老年膿毒癥患者外周血中性粒細胞亞群CD16~(high) CD62~(Llow) CXCR4high與膿毒癥患者病情嚴重性和死亡率呈正相關。2.CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細胞亞群在老年膿毒癥患者中通過CXCR4使其效應性和幼稚型Treg細胞亞群功能增強。3.阻斷CXCR4信號介導老齡膿毒癥小鼠抑制性中性粒細胞亞群歸巢效應,同時提高老齡重癥膿毒癥小鼠生存率。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7

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