本文關(guān)鍵詞：儲存紅細(xì)胞輸注促進(jìn)細(xì)菌感染引發(fā)肝損傷及其作用機(jī)制研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：儲存紅細(xì)胞(red blood cells,RBCs)輸注能誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥、增強(qiáng)感染、引發(fā)膿毒血癥、導(dǎo)致感染性并發(fā)癥,是導(dǎo)致患者死亡的獨(dú)立危險因素,但其具體機(jī)制尚不明確。因此,要解決儲存RBCs輸注誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥及增強(qiáng)感染這一臨床問題,必須加強(qiáng)對其致病機(jī)制的研究。機(jī)體各重要器官,尤其是肝臟,在細(xì)菌感染的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。同時,肝臟在衰老RBCs的清除中也發(fā)揮著重要的作用,是快速清除RBCs和鐵循環(huán)的主要器官。根據(jù)肝臟在細(xì)菌感染及RBCs清除中的調(diào)節(jié)活性及“儲存紅細(xì)胞誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥并增強(qiáng)感染”的理論,我們推測:儲存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染,可能與儲存RBCs輸注加重細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷密切相關(guān)。為對上述推測進(jìn)行驗證,本研究將基于可視化監(jiān)測技術(shù)監(jiān)測儲存RBCs促進(jìn)細(xì)菌感染并引發(fā)肝損傷的作用過程,并對其機(jī)制進(jìn)行探索。雖然Kupffer細(xì)胞與細(xì)菌感染誘導(dǎo)的肝損傷密切相關(guān),而且儲存RBCs輸注與巨噬細(xì)胞之間關(guān)系也已經(jīng)被證實(shí),但儲存RBCs輸注對細(xì)菌感染后肝臟Kupffer細(xì)胞的影響,以及其對肝細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的影響至今未見相關(guān)報道,特別是在細(xì)菌感染期間輸注儲存RBCs后對肝臟Kupffer細(xì)胞極化和活化的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此,本研究將探討儲存RBCs輸注加重細(xì)菌感染并促進(jìn)肝損傷是否與Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān),并分析其引發(fā)肝損傷的分子機(jī)制,旨在了解儲存RBCs對肝臟損傷的調(diào)控及其對細(xì)菌感染的影響,為創(chuàng)傷患者安全輸血提供科學(xué)依據(jù),對提高臨床輸血安全性和有效性具有重要意義。本研究分以下三個部分展開:1.儲存RBCs輸注在體內(nèi)增強(qiáng)銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肝損傷首先,通過發(fā)光細(xì)菌的體外成像,證實(shí)細(xì)菌的熒光素酶活性與細(xì)菌CFU的數(shù)目成正相關(guān)。通過尾靜脈注射銅綠假單胞菌(典型的革蘭氏陰性細(xì)菌)誘導(dǎo)菌血癥建立小鼠模型,利用活體成像分析小鼠體內(nèi)的細(xì)菌感染情況。細(xì)菌的生物發(fā)光讀數(shù)與通過常規(guī)計數(shù)確定的細(xì)菌CFU數(shù)呈正相關(guān),證明生物發(fā)光可以應(yīng)用于監(jiān)測細(xì)菌增殖的變化。為了研究儲存的RBCs輸注對銅綠假單胞菌誘導(dǎo)細(xì)菌感染的影響,在菌血癥小鼠模型中觀察新鮮和儲存RBCs輸注后的效應(yīng),結(jié)果表明,輸入儲存的RBCs可以加劇銅綠假單胞菌感染并降低小鼠的存活率。同時根據(jù)細(xì)菌體內(nèi)成像的信號顯示,感染的最初4h內(nèi)肝臟區(qū)域熒光信號最強(qiáng),說明經(jīng)靜脈感染的銅綠假單胞菌早期主要聚集在小鼠肝臟。儲存RBCs輸注進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌感染小鼠血清ALT和AST的水平升高,與肝切片的組織學(xué)檢查結(jié)果一致。上述實(shí)驗結(jié)果表明,儲存RBCs的輸注促進(jìn)體內(nèi)細(xì)菌增殖,增強(qiáng)銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肝損傷,加劇細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度。2.儲存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷與Kupffer細(xì)胞的極化相關(guān)為了確定輸注儲存RBCs的促炎作用,在銅綠假單胞菌感染的小鼠中監(jiān)測促炎細(xì)胞因子IL-6,IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。當(dāng)銅綠假單胞菌感染的小鼠輸注儲存的RBCs時,感染后2h血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平顯著高于輸入新鮮RBCs的小鼠。上述實(shí)驗結(jié)果表明儲存RBCs輸注可以增強(qiáng)細(xì)菌感染的全身炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步探討這些炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生是否與巨噬細(xì)胞相關(guān),將離體骨髓來源的巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)與儲存RBCs或新鮮RBCs孵育后,再加LPS刺激,結(jié)果顯示儲存RBCs組的上清液中IL-6和TNF-α水平顯著高于新鮮RBCs組,表明與儲存RBCs的孵育顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活化。通過流式細(xì)胞術(shù)測定F4/80+巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)記物,結(jié)果表明:與用新鮮RBCs處理的巨噬細(xì)胞相比,用儲存RBCs處理的巨噬細(xì)胞M1特異性標(biāo)記表達(dá)水平更高,而表達(dá)的M2特異性標(biāo)記則沒有顯著差異。上述體外結(jié)果提示:M1-極化的巨噬細(xì)胞在由儲存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷中可能發(fā)揮重要作用。為了確定輸入儲存的RBCs對小鼠肝臟中Kupffer細(xì)胞的影響,對輸注儲存RBCs后小鼠肝臟中的Kupffer細(xì)胞表型標(biāo)記物進(jìn)行檢測。PCR實(shí)驗結(jié)果表明,儲存RBCs的輸注導(dǎo)致銅綠假單胞菌感染小鼠肝臟中的Kupffer細(xì)胞表型出現(xiàn)明顯變化。與新鮮RBCs組相比,來自儲存RBCs組的組織樣品iNOS、TNF-α和MCP1 mRNA水平升高,顯示儲存RBCs的體內(nèi)輸注可以促進(jìn)在肝臟的Kupffer細(xì)胞朝向M1表型的極化。體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果也證實(shí)了M1-極化的巨噬細(xì)胞的確參與儲存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷過程。3.儲存的RBCs通過干擾細(xì)菌感染小鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB和JNK信號通路間的動態(tài)平衡誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡為進(jìn)一步探討儲存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)肝損傷的作用機(jī)制,本部分結(jié)合實(shí)驗室前期建立的肝臟NF-κB(nuclear factor-kappa B,核因子κB)、caspase-3可視化小鼠模型,研究儲存RBCs輸注對細(xì)菌感染小鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB和JNK(c-Jun N-terminal kinase,c-Jun氨基末端激酶)信號通路間的影響。NF-κB激活對維持肝細(xì)胞存活起重要作用,通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)將pattB-NF-κB-Fluc報告基因整合到小鼠肝細(xì)胞中,可以通過生物熒光成像(BLI)監(jiān)測NF-κB的動態(tài)活化。實(shí)驗數(shù)據(jù)表明,細(xì)菌感染上調(diào)小鼠肝臟NF-κB的激活,而儲存RBCs的輸注抑制了細(xì)菌感染引起的NF-κB活化。這一結(jié)果也由EMSA(Electrophoretic mobility-shift assay,電泳遷移位移試驗)實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)。同樣通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)建立帶有Caspase-3報告基因attB-ANLuc(DEVD)BCLuc的小鼠整合模型,通過BLI評估caspase-3活性。實(shí)驗結(jié)果表明儲存RBCs輸注進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)菌感染引起的肝細(xì)胞JNK和caspase-3信號通路的活化。Western Blot結(jié)果顯示,與來自儲存RBCs組的肝臟樣品相比,來自新鮮RBCs組肝樣品中的p65蛋白磷酸化水平顯著降低。以上結(jié)果表明,NF-κB信號通路在儲存RBCs輸入的銅綠假單胞菌感染小鼠中被抑制,而JNK介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡途徑被增強(qiáng)。因此,儲存的RBCs可能通過干擾NF-κB存活途徑和JNK死亡途徑之間的動態(tài)平衡,進(jìn)一步誘導(dǎo)肝損傷。總之,我們的研究結(jié)果顯示儲存RBCs的輸注增強(qiáng)體內(nèi)細(xì)菌感染誘導(dǎo)的肝損傷,加劇細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度,降低銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率。儲存的RBCs輸注增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生,這些細(xì)胞因子在銅綠假單胞菌感染引發(fā)小鼠細(xì)菌感染相關(guān)的肝損傷中起重要作用。進(jìn)一步研究表明,儲存RBCs促進(jìn)肝損傷與M1型Kupffer細(xì)胞極化相關(guān)。M1型Kupffer細(xì)胞及其分泌的促炎細(xì)胞因子通過增強(qiáng)JNK活化和抑制NF-κB活化來發(fā)揮其對肝細(xì)胞的作用,提示輸注儲存的RBCs破壞了肝臟中細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡之間的平衡。這一作用機(jī)制的闡明對臨床安全輸血具有一定的指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R457.1

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本文編號：1376331