本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微泡生物學(xué)特性及促進造血干細(xì)胞體外擴增作用的研究

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【摘要】：研究目的 近年來,異基因造血干細(xì)胞移植已經(jīng)成為了治療惡性血液系統(tǒng)疾病和各類免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的最佳方法之一。隨著細(xì)胞治療和造血干細(xì)胞移植的不斷發(fā)展,動員后外周血造血干細(xì)胞便于采集,侵入性小并且可短期多次獲取,逐漸取代了骨髓干細(xì)胞,成為造血干細(xì)胞移植和細(xì)胞治療的主要細(xì)胞來源。盡管如此,細(xì)胞數(shù)量不足,病人無法獲得足夠多的供者細(xì)胞,仍然是鉗制移植發(fā)展的主要瓶頸。本實驗旨在尋求安全有效的方法,在體外擴增外周血造血干細(xì)胞,以期獲得效用良好的細(xì)胞產(chǎn)品,為臨床應(yīng)用提供發(fā)展的新思路。研究內(nèi)容1.從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取微泡,并從形態(tài)學(xué)特征,蛋白濃度測定和表面標(biāo)志三個方面鑒定微泡。2.在實驗中,我們首先選擇了間充質(zhì)干細(xì)胞微泡作為擴增方法。利用間充質(zhì)干細(xì)胞微泡與動員后外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng),觀察微泡對GPBMC的作用。3.在此基礎(chǔ)上,我們還利用了芳香烴受體抑制劑SR-1作為添加物。SR-1是一種嘌呤衍生物,它能夠在擴增造血干細(xì)胞的基礎(chǔ)上維持其自我更新的能力。本實驗中,我們將微泡聯(lián)合SR-1與外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng),觀察其擴增作用。4.對擴增后的細(xì)胞在小鼠體內(nèi)進行了初步的有效性和安全性驗證。研究方法 1.通過培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞獲取培養(yǎng)上清,利用超速離心機,多步差速離心法分離并提純上清中間充質(zhì)干細(xì)胞的分泌物。通過將提取物負(fù)染,在透射電鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征；用Micro-BCA試劑盒對微泡進行蛋白濃度的測定,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度；最后,利用流式細(xì)胞術(shù)分析提取物所表達的表面標(biāo)志。2.探究了微泡對外周血造血干細(xì)胞的擴增作用。實驗分為對照組和微泡組,微泡組內(nèi)加入10mg/L微泡,對照組內(nèi)加入相同體積PBS緩沖液。采用液體培養(yǎng)法,將從供者動員后外周血中提取出的單個核細(xì)胞與微泡共培養(yǎng),通過細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞在培養(yǎng)后的數(shù)量變化；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)后的單個核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞含量的動態(tài)變化情況；用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基對培養(yǎng)后的造血干細(xì)胞行集落培養(yǎng),觀察其在體外的功能；分析染色體核型變化,以觀察培養(yǎng)前后的細(xì)胞是否有染色體畸變等情況。3.在微泡組實驗的基礎(chǔ)上,在相同培養(yǎng)體系內(nèi)加入了SR-1小分子制劑。實驗分為四組,即對照組,微泡組,SR-1組,混合組。其中,微泡組中加入10mg/L的微泡,SR-1濃度為0.75μM,混合組為10mg/L微泡+0.75μM SR-1,對照組則加入等體積PBS緩沖液。我們通過細(xì)胞計數(shù),細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定,集落培養(yǎng)和染色體核型分析等方法,檢測微泡與SR-1聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞的擴增情況。4.從以上實驗組中篩選出在細(xì)胞數(shù)目得到擴增的同時保持CD34+細(xì)胞數(shù)量與能力不減弱的實驗組,對小鼠進行初步的體內(nèi)實驗探究,以在體內(nèi)驗證獲得的擴增細(xì)胞的有效性及安全性。實驗分為兩組,實驗組與對照組。實驗組輸入培養(yǎng)后的細(xì)胞,對照組輸入新鮮采集的外周血干細(xì)胞。給予NPG小鼠2Gy TBI全身照射,采用流式分選的方法,將培養(yǎng)后細(xì)胞與新鮮采集的細(xì)胞中CD34-細(xì)胞分選出來,向兩組小鼠分別輸入1×105的CD34-細(xì)胞。觀察小鼠血象恢復(fù),利用流式細(xì)胞術(shù)分析1w,4w小鼠體內(nèi)人鼠細(xì)胞嵌合比例、血象恢復(fù)情況與生存率情況。結(jié)果 1.證實通過多步差速離心法能夠成功提取微泡,電鏡下可見微泡是直徑在20-100nm的類圓形囊泡,這與文獻中已經(jīng)報道過的的胚胎干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞來源的微泡特征一致；蛋白定量的結(jié)果顯示,計算所得平均每1×106個間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲取微泡10μg；間充質(zhì)干細(xì)胞微泡表面標(biāo)志結(jié)果顯示,CD63與CD44陽性表達,CD63表達率96.0%,CD44表達陽性,而HLA-DR,CD34,CD29等表達均為陰性。從電鏡下形態(tài)學(xué)特征,蛋白定量和表面標(biāo)志的檢測,認(rèn)為通過此方法獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物是微泡。2.實驗結(jié)果顯示,微泡對外周血單個核細(xì)胞具有促進增殖的作用,微泡組有明確促進造血干細(xì)胞擴增的作用,細(xì)胞數(shù)量隨共培養(yǎng)的時間延長而增加。起始種植細(xì)胞為1×106個,2d時微泡組細(xì)胞數(shù)(3.34±0.44×106)是對照組(2.24±0.26)的1.49±0.15倍(P0.05)；4d時微泡組細(xì)胞數(shù)(10.19±0.65×106)是實驗組細(xì)胞數(shù)(4.67±0.70×106)的2.20±0.24倍(P0.05),6d時微泡組細(xì)胞(27.15±3.28×106)是實驗組細(xì)胞數(shù)(11.40±0.58×106)的2.37±0.21倍(P0.05)。結(jié)合細(xì)胞總數(shù)與CD34+細(xì)胞的比例,我們發(fā)現(xiàn)2d時,對照組與微泡組中CD34+比例相差不大；4d時,對照組中CD34+比例高于微泡組。將CD34+比例與細(xì)胞總數(shù)綜合分析,2d時微泡組CD34+細(xì)胞數(shù)(3.93±0.60×104)是對照組(2.30±0.64×104)的1.76±0.30倍；4d時微泡組CD34+細(xì)胞數(shù)(7.82±0.41×104)是對照組(4.03±0.35×104)的1.95±0.20倍。此外,微泡組中的CD34+細(xì)胞具有在體外形成集落的能力,經(jīng)過長時間培養(yǎng)后染色體正常,無畸變。3.實驗結(jié)果表明,單獨使用SR-1與造血干細(xì)胞共培養(yǎng),2d時細(xì)胞數(shù)量(2.07±0.21×106)和4d時細(xì)胞數(shù)量(5.34±0.58×106)與對照組均無明顯差異(P0.05)：SR-1聯(lián)合MV的混合組與造血干細(xì)胞共培養(yǎng),2d時細(xì)胞數(shù)量(2.38±0.34×106)與對照組無明顯差異(P0.05),4d時細(xì)胞數(shù)量(6.56±0.86×106)是對照組的1.42±0.22倍(P0.05)； SR-1組整體細(xì)胞數(shù)量無明顯差異,2d時CD34+細(xì)胞的絕對數(shù)(3.27±1.47×104)與4d時CD34+細(xì)胞絕對數(shù)(4.61±0.63×104)均略高于對照組。與微泡組相比,M+S組細(xì)胞擴增倍數(shù)低,但2d時CD34+細(xì)胞數(shù)量(5.42±1.64×104)與4d時(8.83±2.50×104)比同時間微泡組中CD34+細(xì)胞數(shù)量均高。4.實驗結(jié)果顯示,小鼠血中人鼠細(xì)胞比例嵌合在4w左右均達到10%左右,對照組與實驗組間無明顯差異。結(jié)論利用多步差速離心法可成功提取出間充質(zhì)干細(xì)胞微泡,間充質(zhì)干細(xì)胞微泡對外周血造血干細(xì)胞有促進擴增的作用；間充質(zhì)干細(xì)胞微泡與SR-1聯(lián)合與造血干細(xì)胞微泡培養(yǎng)能夠使細(xì)胞擴增并能較好地維持其干性。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7

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本文編號：1204214