代謝工程改造已成為提高微生物天然生產(chǎn)及異源合成各種高附加值產(chǎn)物產(chǎn)量與得率的常用技術(shù)手段。傳統(tǒng)代謝工程技術(shù)多采用靜態(tài)控制策略,主要為合成途徑限速酶的過表達(dá)、競爭途徑的敲除/低、ATP供應(yīng)的優(yōu)化控制、氧化還原反應(yīng)的平衡及前體代謝的調(diào)控等,以此重新分配穩(wěn)態(tài)通路的通量。但是,這種工程菌株往往不能對基因表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)響應(yīng)及調(diào)控,適應(yīng)環(huán)境變化的魯棒性低。動(dòng)態(tài)控制策略可以使細(xì)胞持續(xù)感應(yīng)培養(yǎng)體系的環(huán)境變化,重新平衡核心代謝途徑的通量,調(diào)控生理狀態(tài)及代謝特征。因此,動(dòng)態(tài)控制可以更好地平衡菌株生長、代謝與目標(biāo)產(chǎn)物合成,減少有毒中間體的積累,而且異源途徑酶表達(dá)的動(dòng)態(tài)控制可以有效地降低外源多酶共表達(dá)的代謝壓力。近年來,啟動(dòng)子文庫的高通量篩選及合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,為動(dòng)態(tài)控制策略的實(shí)現(xiàn)提供了重要支持,但目前有關(guān)動(dòng)態(tài)控制策略的報(bào)道多集中于原核細(xì)胞,酵母及高等真核細(xì)胞的工作則很少,這主要與真核細(xì)胞復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制有關(guān)。丙二酰輔酶A（Mal-CoA）是聚酮、黃酮、脂肪酸等活性分子生物合成的重要前體,也是參與細(xì)胞生理反應(yīng)的關(guān)鍵代謝分子。通常情況下,細(xì)胞內(nèi)Mal-CoA濃度很低,提取定量后進(jìn)行代謝調(diào)控存在諸多困難,在... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１酵母Ａｃｃｌ保守功能域??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｄｏｍａｉｎ?ｏｆ?Ａｃｃｌ?ｉｎ?ｙｅａｓｔ．??１．２．３丙二酰輔酶Ａ衍生化合物??

高附加值Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生??化合物，更是引起了研宄人員的廣泛興趣。Ｍａｒｘ等ｆ３５］報(bào)道了通過用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子Ｐｍｐ??取代天然啟動(dòng)子在酵母中異源高效合成核黃素的途徑。使用具有三個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)的??途徑基因的工程化酵母，用于生產(chǎn)生物柴油，也取得了進(jìn)展％。本實(shí)驗(yàn)室高麗梅碩士??（６－ＭＳＡ）［３７］、劉一奇博士（洛伐他汀和莫納可林乃網(wǎng)、薛莖碩士（梧霉素）岡、孔垂杏碩??士（土曲霉酸）等，己成功實(shí)現(xiàn)各類聚酮化合物在畢赤酵母中的異源合成。??各類Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生化合物在細(xì)胞內(nèi)的合成途徑如圖１．２所示。整個(gè)代謝途徑的限速??步驟在于Ｍａｌ－ＣｏＡ。由于Ｍａｌ－ＣｏＡ與細(xì)胞生長以及磷脂和脂肪酸的合成直接相關(guān)，細(xì)??胞內(nèi)濃度受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)，維持在非常低的水平，難以定量調(diào)控，可用性被限制，影響了??一系列下游化合物的合成。隨著在生物合成級聯(lián)反應(yīng)中引入新基因，對細(xì)菌進(jìn)行工程改??造，在細(xì)胞生長所需的Ｍａｌ－ＣｏＡ和產(chǎn)物合成之間實(shí)現(xiàn)新陳代謝的平衡，是至關(guān)重要的。??細(xì)胞內(nèi)Ｍａｌ－ＣｏＡ的有效利用，仍然是生產(chǎn)聚酮化合物和黃酮等的最大障礙之一。對不??同碳源而言，葡萄糖廉價(jià)且安全，但對于Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生物合成而言，葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)??代謝為Ｍａｌ－ＣｏＡ代謝步驟多，分支繁雜。乙醇作為碳源，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過乙醇－乙醛－乙酸??－乙酰輔酶Ａ四個(gè)步驟，即可生成Ｍａｌ－ＣｏＡｌ３８】。因此，乙醇作為一種碳源用于Ｍａｌ－ＣｏＡ??的合成，是很有潛力的。本課題所用畢赤酵母為非葡萄糖效應(yīng)酵母，具有高效的乙醇同??化能力，可有效促進(jìn)Ｍａｌ－ＣｏＡ的合成［３８］。??Ｇｌｕｃｏｓｅ??Ｐｙｒｕｖａｔｅ?????｜Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ?｜．?Ｂｊ０．ｐ０｜ｙ

ｔｏｒ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｂ?Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ?ｏｆ?ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ??Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?Ａｃｔｉｎｇ?ｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｉｎ??ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??＿?ＮＵＣ［ｔ＾〇ｍｅ?化??ｄ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｅｓｃａｐｅ?ｃ?ＰＩＣ?ｆｏｒｍａｔｉｏｎ??ｉ＞?Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ?Ｐｏｌ?ＩＩ?＼?ＴＦｌ＾ｔ＾ＴＦＩＩＨ?Ｍｅｄｉａｔｏｒ??ｙ?＾ＪｃＶ?ＣＴＤ?ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ?Ｍ?＾?＿??ｐｌｃ??圖１．５?ＲＮＡ聚合酶ＩＩ介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄過程??Ｆｉｇ．?１．５?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｂｙ?ＲＮＡ?ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?ＩＩ［１２０ｌ??１．６本課題設(shè)計(jì)背景及原理??Ｍａｌ－ＣｏＡ是所有活細(xì)胞脂肪酸合成的重要中間體，也是革蘭氏陽性菌脂質(zhì)平衡調(diào)節(jié)??過程中的全局調(diào)控因子。體外轉(zhuǎn)錄和結(jié)合研宄表明，Ｍａｌ－ＣｏＡ是枯草芽孢桿菌ＦａｐＲ的??直接特異性誘導(dǎo)劑。ＦａｐＲ是一種保守的轉(zhuǎn)錄抑制因子，調(diào)控參與細(xì)菌脂肪酸和磷脂合??成的多個(gè)基因的表達(dá)。序列分析表明，ＦａｐＲ像許多細(xì)菌抑制因子一樣，具有Ｎ端ＤＮＡ??結(jié)合域（ＤＢＤ），可與一段３４?ｂｐ的ＤＮＡ序列／�。ǎ菇Y(jié)合（Ａ?＝?０．１２?ｐｍｏｌ／Ｌ）；同時(shí)Ｃ端??的晶體結(jié)構(gòu)揭示了?ＦａｐＲ是一種具有硫酯酶樣“熱狗”折疊的同源二聚體蛋白，其類似??于幾種己知的結(jié)合�；o酶Ａ底物的硫酯酶，可特異性結(jié)合Ｍａｌ－ＣｏＡ?（ＡＴｄ?＝?２．４?ｐｍｏｌ／Ｌ）。??Ｎ端和Ｃ端結(jié)構(gòu)域通過一個(gè)ａ螺旋連接（圖１．６）。??ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ??ｄｏｍａｉｎ?Ｍａｌ－ＣｏＡ?ｂｉｎｄ

【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]基于甲醇/乙醇底物的洛伐他汀及莫納可林J異源生物合成[D]. 劉一奇.華東理工大學(xué) 2018



本文編號：2907555